荧光增白剂 （fluorescent whitening agents，FWAs）是一种无色的荧光染料[1]，俗称“白色”染料[2]，也是一种复杂的有机化合物。最初的荧光增白剂广泛用于纺织品、造纸、涂料、洗涤用品和塑料制品等多个领域，既可以提高基质的白度，也可以保证基质的亮度[3]。随着荧光增白剂的使用越来越普及，某些不法商家为了商品的增白效果和获取更多的利益，向食品包装中违规加入荧光增白剂，使食品接触性材料领域中荧光增白剂安全问题不断涌现。据报道，2011年上半年，北京、上海、西安、广州等地的影院所使用的爆米花桶就检出过存在非法添加荧光增白剂的案例[4]。不法商家也可能为了掩盖食品发黄或霉变的事实，往食品中直接添加荧光增白剂，达到增白的效益。甚至商家为了使食品包装材料增白增亮而使用荧光增白剂，而荧光增白剂通过迁移污染食品内容物，从而导致食品中可能含有荧光增白剂。国内有报道证实称鲜猪皮、鲜蘑菇等食品中直接或间接人为地受到荧光增白剂的污染[5]。随着媒体的频繁曝光，大众对食品及接触性材料安全性的关注度不断提高。然而荧光增白剂在使用安全性上存在一些争议[3，6]，医学临床实验证明，荧光增白剂和皮肤蛋白质结合力很强，不易洗去，结合后会对皮肤产生刺激，导致过敏或发炎等症状[7]，一旦荧光增白剂在人体内蓄积，就会存在削弱人体免疫力及伤口愈合能力、危害肝脏等其他重要器官的风险，甚至有可能诱发细胞癌变[8]。美国[9]、中国[10]等国家及欧盟[11]都将荧光增白剂作为食品接触性塑料制品的添加剂进行监管，规定了相关的限用量和/或特定的迁移量，制订了相关的检测标准。食品接触性材料的检测方法日趋成熟，此前已有大量报道，但至今为止只有少数研究如食用菌[12-13]、面粉[14]、食用油[15]以及自制食品模拟物[16]建立食品中可能含有荧光增白剂的检测方法。因此本试验建立大米中荧光增白剂的检测方法可以为食品安全问题的风险控制提供重要参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大米：市售。
甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）：美国TEDIA公司；四丁基溴化铵（tetrabutyl ammonium bromide，TBA，分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司。
11种荧光增白剂标准品：FWA5bm（98μg/mL）、C.I85（101 μg/mL）、C.I 113（108 μg/mL）、C.I 71（146 μg/mL）、C.I 90（111 μg/mL）、C.I 24（100 μg/mL）、C.I 210（102 μg/mL）、C.I 220（101 μg/mL）、C.I 264（112 μg/mL）、C.I 357（104 μg/mL）、C.I 353（103 μg/mL）：福州绿川生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LC-20AT高效液相色谱仪（配有二极管阵列检测器）：日本岛津SHIMADZU公司；ML204/02万分之一电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；3-3KS高速冷冻离心机：美国Sigma公司；Milli-Q去离子水发生器：美国Millipore公司；MS3漩涡混合器：德国IKA公司；JP-C400超声波清洗器：广州市吉普超声波电子设备有限公司；CM200-2氮吹浓缩仪：北京成萌伟业科技有限公司；移液管（1 mL）：天津玻璃仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 标准溶液配制
10 μg/mL混合标准品使用液1：分别准确移取适量体积的C.I 220，C.I 210，C.I 85，C.I 357，C.I 90，FWA5bm标准品储备液于10 mL棕色容量瓶中，40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）定容。标准品色谱图见图1。
图1 混合标准品1的色谱图
Fig.1 Chromatogram of mixed standard substance 1
10 μg/mL混合标准品使用液2：分别准确移取适量体积的 C.I 24，C.I 264，C.I 353，C.I 71 标准品储备液于10 mL棕色容量瓶中，40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）定容。标准品色谱图见图2。
图2 混合标准品2的色谱图
Fig.2 Chromatogram of mixed standard substance 2
10 μg/mL标准品使用液3：准确移取适量体积的C.I 113标准品储备液于10 mL棕色容量瓶中，40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）定容。标准品色谱图见图3。
图3 标准品3的色谱图
Fig.3 Chromatogram of standard substance 3
用40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）将3 个标准品使用液分别逐级稀释为 0.1、0.2、0.5、0.8、1、2、5、8、10 μg/mL 的系列标准工作液。
1.3.2 样品前处理
精确称取1 g（精确至0.001 g）大米样品于50 mL具塞离心管中，加入1 mL 40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）漩涡提取30 s，8 000 r/min下离心2 min，取上清液，重复以上步骤再提取1次，合并上清液，30℃下氮吹浓缩至近干，加入1 mL40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）溶解定容，漩涡30 s，超声10 s，过0.45 μm有机滤膜，弃去初滤液，取续滤液，待测。试验过程全程避光操作。
1.3.3 液相色谱条件
色谱柱：Eclipse Plus C18柱（5 μm，4.6×250 mm）；流动相（A）：乙腈 ∶甲醇（2∶3，体积比）；流动相（B）：含25 m mol TBA的甲醇-水（5∶95，体积比，三乙胺调pH值至 8.0）；柱温：35 ℃；检测波长：350 nm；进样量：20 μL；流动相与梯度洗脱条件见表1。
表1 流动相与梯度洗脱条件
Table 1 Gradient program of the mobile phase
时间/min流速/（mL/min）A/%B/%0 1.0 60 40 10 15 15.01 25 1.0 1.0 1.0 1.0 70 80 60 60 30 20 40 40
2 结果与分析
2.1 前处理条件的优化
2.1.1 提取条件的优化
对不同提取条件进行比对，包括提取溶剂及提取次数。自制阳性样品的对比结果见表2和表3。
表2 不同提取溶剂对11种荧光增白剂回收率的影响（n=6）
Table 2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）
提取溶剂 平均回收率/%C.I 220 C.I 210 C.I 85 C.I 357 C.I 90 FWA5bm C.I 24 C.I 264 C.I 353 C.I 71 C.I 113 40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5） 94.2 95.7 92.3 97.9 100.0 93.6 98.5 102.0 91.2 87.7 97.7 40%乙腈-水溶液 8.9 8.4 3.2 13.3 5.7 4.3 21.2 22.0 17.9 24.8 16.8甲醇 22.8 18.8 4.0 11.2 2.4 0.0 27.3 42.0 31.7 48.1 19.1乙腈 10.8 11.5 2.9 19.4 3.5 1.3 24.0 35.2 28.1 14.7 14.2纯水 6.9 7.3 0 10.7 0 0 0 0 0 0 0流动相 47.5 48.8 8.5 36.9 1.4 1.4 56.4 75.3 48.3 6.1 47.7
表3 不同提取次数对11种荧光增白剂回收率的影响（n=6）
Table 3 Effect of different extraction times on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）
提取次数 平均回收率/%C.I 220 C.I 210 C.I 85 C.I 357 C.I 90 FWA5bm C.I 24 C.I 264 C.I 353 C.I 71 C.I 113提取1次 71.2 72.3 66.3 62.5 72.2 57.6 83.8 78.2 72.9 54.7 58.2提取2次 90.0 89.4 88.4 89.2 98.8 86.7 96.3 101.6 95.5 86.5 88.0
从表2中可以看出，40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）作为提取溶剂时，自制阳性样品中11种荧光增白剂的回收率为87.7%～102.0%，明显优于其他提取溶剂，其他提取溶剂的回收率均低于80.0%；从表3中可以看出，提取2次时，自制阳性样品中11种荧光增白剂的回收率为86.5%～101.6%，明显优于提取1次时的回收率，提取1次的回收率均低于84.0%。因此，本试验确定的提取条件为40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）作为提取溶剂，提取次数为2。
2.1.2 氮吹条件的优化
对不同氮吹条件进行比对，包括氮吹温度及程度。自制阳性样品的对比结果见表4和表5。
从表4中可以看出，氮吹温度为30℃时，自制阳性样品中11种荧光增白剂的回收率为73.9%～101.6%，优于其他氮吹温度，其他氮吹温度下部分待测物的回收率低于60.0%；从表5中可以看出，氮吹至近干时，自制阳性样品中11种荧光增白剂的回收率为78.2%～103.3%，优于氮吹至干，氮吹至干后部分待测物的回收率低于60.0%。因此，本试验确定的氮吹条件为在30℃下氮吹至近干。
表4 不同氮吹温度对11种荧光增白剂回收率的影响（n=6）
Table 4 Effect of different nitrogen blowing temperatures on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）
氮吹温度/℃ 平均回收率/%C.I 220 C.I 210 C.I 85 C.I 357 C.I 90 FWA5bm C.I 24 C.I 264 C.I 353 C.I 71 C.I 113 20 80.7 67.4 47.3 75.6 45.6 32.8 88.2 99.9 78.9 36.5 56.8 30 91.0 92.5 88.6 97.0 86.2 73.9 93.4 101.6 87.7 83.6 84.7 40 78.3 73.6 51.5 80.7 45.4 33.7 90.9 101.0 79.2 24.8 46.5 50 89.1 87.2 62.1 91.6 58.4 44.8 84.0 99.7 77.7 38.8 51.1
表5 不同氮吹程度对11种荧光增白剂回收率的影响（n=6）
Table 5 Effect of different nitrogen blowing degrees on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）
氮吹程度 平均回收率/%C.I 220 C.I 210 C.I 85 C.I 357 C.I 90 FWA5bm C.I 24 C.I 264 C.I 353 C.I 71 C.I 113干 77.0 78.9 61.1 83.9 52.9 40.8 85.9 97.6 77.3 48.1 52.4近干 91.1 84.1 78.3 90.5 84.1 78.2 94.1 103.3 87.7 79.2 80.7
2.1.3 氮吹后定容溶剂的优化
对氮吹后不同定容溶剂进行比对，自制阳性样品的对比结果见表6。
从表6中可以看出，不同的定容溶剂对于自制阳性样品中11种荧光增白剂的回收率影响相差较大，40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）作为氮吹后定容溶剂时，自制阳性样品中11种荧光增白剂的回收率为77.7%～98.7%，明显优于其他的溶剂，其他定容溶剂的回收率均低于55.0%。因此，本试验确定的氮吹后定容溶剂为40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至 11.5）。
表6 不同定容溶剂对11种荧光增白剂回收率的影响（n=6）
Table 6 Effect of different constant volume solvents on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）
定容溶剂 平均回收率/%C.I 220 C.I 210 C.I 85 C.I 357 C.I 90 FWA5bm C.I 24 C.I 264 C.I 353 C.I 71 C.I 113 40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5） 87.6 91.5 84.4 94.6 80.8 81.2 86.2 98.7 77.7 78.6 81.8 40%乙腈-水溶液 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0甲醇 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0乙腈 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0流动相 54.8 17.8 26.0 30.9 3.8 4.5 16.5 52.7 27.1 2.8 15.0
2.1.4 初滤液取舍的优化
本研究对上机检测前的初滤液取舍进行比对，自制阳性样品的对比结果见表7。
从表7中可以看出，上机检测前是否弃去初滤液对于自制阳性样品中11种荧光增白剂的回收率影响相差较大，弃去初滤液后上机检测，自制阳性样品中11种荧光增白剂的回收率为78.2%～99.9%，各待测物的回收率均高于保留全部滤液时的回收率。因此，本试验确定在上机检测前的过滤需弃去初滤液，取续滤液。
表7 初滤液取舍对11种荧光增白剂回收率的影响（n=6）
Table 7 Effect of accepting or rejecting primary filtrate on the recoveries of 11 kinds of fluorescent whitening agent（n=6）
初滤液取舍 平均回收率/%C.I 220 C.I 210 C.I 85 C.I 357 C.I 90 FWA5bm C.I 24 C.I 264 C.I 353 C.I 71 C.I 113保留初滤液 79.6 75.5 71.9 83.6 68.9 62.8 72.6 91.6 72.9 61.8 69.4弃初滤液 93.6 94.1 82.4 97.1 80.8 78.2 87.0 99.9 91.3 82.8 80.4
2.2 线性关系、相关系数和检出限
11种荧光增白剂的线性范围均为0.1 μg/mL～10 μg/mL。自制阳性样品在优化的条件下，根据试验方法处理，上机根据S/N＞3确定方法的检出限（limit of detection，LOD），以待测物的峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X，μg/mL）绘制标准曲线。本方法的线性方程、相关系数及检出限见表8。
表8 11种荧光增白剂的线性方程、相关系数及检出限
Table 8 Regression equations，correlation coefficients and LODs of 11 kinds of fluorescent whitening agent
待测物 线性关系 相关系数R2 检出限/（μg/g）C.I 220 Y=21 007.54X+160.775 1 0.999 970 2 0.1 C.I 210 Y=45 441.67X+518.409 3 0.999 981 9 0.1 C.I 85 Y=16 408.93X+245.777 0.999 980 4 0.1 C.I 357 Y=21 792.08X+520.931 9 0.999 984 9 0.1 C.I 90 Y=35 314.47X-9.822 658 0.999 949 3 0.1 FWA5bm Y=57 687.11X+705.866 8 0.999 985 9 0.1 C.I 24 Y=22 910.44X+153.226 1 0.999 980 3 0.1 C.I 264 Y=28 985.67X+131.393 9 0.999 974 1 0.1 C.I 353 Y=9 864.286X+160.223 2 0.999 938 3 0.1 C.I 71 Y=39 340.19X+154.858 4 0.999 971 7 0.1 C.I 113 Y=23 926.58X+56.739 61 0.999 989 2 0.1
结果表明，11种荧光增白剂在各自线性范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.999 9。该方法线性关系良好，灵敏度高。
2.3 回收率和精密度
在阴性样品中加入标准物质，进行添加水平为0.5、0.8、1.0 μg/mL的加标回收率试验，每个添加水平重复6次，11种荧光增白剂的回收率和精密度具体结果见表9。
表9 大米中11种荧光增白剂的回收率和精密度（n=6）
Table 9 Recoveries and RSDs of 11 kinds of fluorescent whitening agent in rice（n=6）
待测物收率/% RSD/% 平均回0.5 μg/mL 0.8 μg/mL 1.0 μg/mL平均回收率/% RSD/% 平均回收率/% RSD/%C.I 220 64.5 5.1 75.1 3.9 89.0 2.7 C.I 210 63.1 4.0 72.7 1.1 74.7 1.3 C.I 85 59.3 2.5 60.7 3.3 77.7 2.8 C.I 357 65.3 2.7 66.4 4.3 79.2 4.6 C.I 90 71.2 3.1 75.7 5.7 81.1 2.3 FWA5bm 61.2 2.4 64.4 4.6 71.6 2.1 C.I 24 67.4 4.5 68.8 4.4 70.8 2.8 C.I 264 81.8 2.9 79.8 3.5 81.8 1.8 C.I 353 66.6 3.9 68.9 3.4 70.4 5.8 C.I 71 80.4 4.1 83.2 2.6 86.1 2.5 C.I 113 74.2 4.6 76.0 2.0 78.3 2.3
3个添加水平的平均回收率为59.3%～89.0%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为 1.1%～5.8%，表明方法具有良好的准确度和精密度。
2.4 实际样品分析
从市场、超市、粮油店随机购买20个不同品牌的大米，在优化后的条件下进行样品处理和色谱分析检测，结果发现这20个大米样品中均未检出这11种荧光增白剂。但由于大米品种众多，且不排除样品包装材料中的荧光增白剂发生迁移，而大米又是我们平常必不可少的主食之一，因此，建立大米中荧光增白剂的检测方法具有一定的意义。
3 结论
本研究建立高效液相色谱法检测大米中11种荧光增白剂含量的分析方法：样品经40%乙腈-水溶液（三乙胺调pH值至11.5）提取，氮吹浓缩，经C18柱分离，二极管阵列检测器检测，350 nm波长扫描，外标法定量。本方法简单、快速、高效，可满足日常检测的需要，具有应用于大规模检测的实际意义，能为大米中荧光增白剂的风险检测提供有力的基础。
[1]连宗旭.荧光增白剂的应用与思考[J].科技信息,2012(17):133-133
[2]王景国,容建明.国内外荧光增白剂的状况与展望[J].染料与染色,2002,39(1):9-13
[3]董仲生.荧光增白剂的实用性和经济性及其对人与环境的影响[J].中国洗涤用品工业,2011(5):25-35
[4]唐丽丽,孙彬青,汤佳敏,等.食品用纸包装材料中荧光增白剂的检测与分析[J].包装世界,2015(6):56-57
[5]黄建勤,肖剑.荧光增白剂在食品及餐饮行业中的应用及检测方法综述[J].食品工业,2012(7):147-149
[6]Mishra H,Zhang Y,Geddes C D.Metal enhanced fluorescence of the fluorescent brightening agent Tinopal-CBX near silver island film[J].Dyes&Pigments,2011,91(2):225-230
[7]黄蔷,蒋定国,柳洁,等.高效液相色谱法测定食品包装纸中的5种荧光增白剂[J].中国卫生检验杂志,2015(20):3439-3441
[8]冼燕萍,郭新东,穆同娜,等.食品接触塑料容器中限用荧光增白剂184和393的迁移行为研究[J].质谱学报,2014,35(6):530-536
[9]U.S.Food and Drug Administration.Colorants for polymers:Title 21-ChapterⅠ-Subchapter B-Part 178-Subpart D-Section 178.3297[EB/OL].Code of Federal Regulations,(1983-10-14)[2017-04-01].http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfmfr=178.3297
[10]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 9685-2016食品安全国家标准食品接触材料及制品用添加剂使用标准[S].北京:中国标准出版社,2016
[11]Dr Otto G Piringer,Dr Albert L Baner.Community Legislation on Materials and Articles Intended to Come into Contact with Foodstuffs[EB/OL].Plastic Packaging:Interactions with Food and Pharmaceuticals,Second Edition,2002,L 220/18-L 220/58[2008-02-12].https://doi.org/10.1002/9783527621422.ch13
[12]张建莹,肖锋,叶刚,等.超高效液相色谱-串联质谱法检测食用菌中荧光增白剂[J].食品安全质量检测学报,2014(9):2682-2688
[13]张宪臣,李蓉,周艳萍,等.QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定食用菌中7种荧光增白剂[J].分析化学,2017,45(5):777-783
[14]李蓉,何春梅,薄艳娜,等.高效液相色谱-三重四极杆质谱法测定面粉中7种荧光增白剂[J].色谱,2017,35(2):162-168
[15]张云,陈泽宇,吕水源,等.高效液相色谱法测定食用油中10种荧光增白剂迁移量[J].食品工业科技,2015,36(24):82-84
[16]张云,陈泽宇,吕水源,等.高效液相色谱法测定食品模拟物中十种荧光增白剂迁移量[J].海峡科技与产业,2015(11):62-65