黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.),茄科枸杞属,主要生长在我国新疆、青海、甘肃等海拔高、日照足地区,是一种耐干旱、耐盐碱的沙生植物,其果实中含有大量的原花青素、花色苷、多糖、黄酮等营养成分[1]。已有大量的研究报道其具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗疲劳及免疫调节的作用[2-6]。《维吾尔药志》记载,黑果枸杞果实及根皮可治疗尿道结石、癣疥、齿龈出血等症,民间则用作滋补强壮、明目以及降压药[7]。
黑果枸杞多棘刺,采摘困难,果实易破损,成品产率极低,造成其价格昂贵。对次果的充分利用,以及产品食用便利性、有效性是黑果枸杞产业急需解决的问题。目前对果黑果枸杞的研究集中在其所含活性成分的提取优化[2,8-10]、结构表征[11-13]、活性测定[2-6]等。果蔬粉是一种良好的深加工产品[14],开发黑果枸杞速溶粉可以提高黑果枸杞食用便利性、有效性并拓宽其在食品、医药、保健品等领域的应用范围。
喷雾干燥过程物料受热时间短,干燥迅速,能较好保留产品营养成分及风味、便于贮存运输[15-16],是目前产业化过程常用的干燥方式之一。Thunnop[17]对喷雾干燥和冷冻干燥两种干燥方式得到的黑糯米麸皮色素粉进行了研究,发现虽然冷冻干燥所得样品产率、花青素保留率相对较高,但具有很高的操作成本。张妍[18]通过响应面试验优化喷雾干燥,最终得到了冲调性较为理想的核桃分心木速溶粉。梁辰[19]采用超声提取和喷雾干燥工艺制备玛咖速溶粉,提高了玛咖中有效成分的提取率,制备出高品质的玛咖速溶粉。
以黑果枸杞干果为原料,通过超声辅助水提及喷雾干燥制备黑果枸杞速溶粉,为消费市场提供了一种新的产品。但黑果枸杞花青素稳定性差[20],多糖具有较高的黏性,为解决由此产生的速溶粉活性成分损失和干燥过程中雾化不均匀、产品粘壁等问题,本研究通过双重优化即在提取及干燥部分分别进行工艺优化,旨在充分提取黑果枸杞活性成分并获得得率高、品质优良的黑果枸杞速溶粉。
黑果枸杞:内蒙古产。
无水乙醇、盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝:北京化工厂;氯化钾、氢氧化钠、柠檬酸:西陇化工股份有限公司;结晶乙酸钠:天津市福晨化学试剂厂。
TDL-5-A型大容量常温离心机:上海安亭科学仪器厂;WF2UV-2802H分光光度计:上海尤尼柯仪器有限公司;CTXNW-2B超声加热循环提取机:北京弘祥隆生物技术股份有限公司;RE-6000旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;真空脉动超声干燥机:中国科学院过程工程研究所生化国家重点实验室自主研发;LPG-10喷雾干燥机:南京凯欧机械制造有限公司;Mastersizer 2000 E激光粒度分析仪:英国马尔文仪器有限公司;JSM 6700F冷场发射扫描电子显微镜:日本电子株式会社(JEOL)。
1.3.1 花色苷测定方法
采用pH示差法[21],配置pH值分别为1.0和4.5的缓冲溶液,量取0.5 mL黑果枸杞花色苷溶液,分别加入pH=1.0和pH=4.5缓冲溶液,室温下放置30分钟后于530 nm和700 nm波长下分别测定黑果枸杞花色苷在在上述两种缓冲液中的吸光值A。
黑果枸杞花色苷含量计算公式:
式中:ΔA为吸光度差值;Mw为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子量(取449.2);DF为稀释倍数;ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数[26 900 L/(mol·cm)];L为比色皿光程(1 cm);c为待测液中黑果枸杞花色苷浓度,g/mL;V为溶液体积,mL;M为黑果枸杞干果质量,g;Y为黑果枸杞干果花色苷得率,mg/100 g。
1.3.2 超声辅助提取
原料粉碎过40目筛,以0.01%柠檬酸水溶液为提取溶剂,通过单因素试验和正交试验优化超声辅助提取黑果枸杞花色苷工艺。柠檬酸的作用是使提取液呈酸性状态来提高花色苷的稳定性[20]。
1.3.2.1 单因素试验
以花色苷得率为指标,研究超声功率、料液比、提取温度、提取时间4个因素对花色苷提取效果的影响。固定其中3个因素,以第四个因素为变量依次研究。
1.3.2.2 正交试验
根据单因素试验的结果选定超声设备最大功率400 W,考察料液比(A),提取温度(B),提取时间(C)对花色苷得率的影响。正交因素水平设计见表1。
表1 试验因素与水平设计
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平 因素A料液比/(g/mL)B提取温度/℃C提取时间/min 1 1∶10 20 30 2 1∶15 30 50 3 1∶20 40 70
1.3.3 干燥工艺比较与优化
根据最佳提取工艺条件,制备黑果枸杞水提液,分别采用喷雾干燥、热风干燥(70℃)、超声干燥、冷冻干燥方式对水提液进行干燥。为提高后3种干燥方式的干燥速率,需将提取液预先浓缩(喷雾干燥无需浓缩处理)。比较4种干燥方式对产品物理特征及花色苷得率、含量的影响,优选喷雾干燥为黑果枸杞提取液干燥方式。采用Design-Expert 8.0.5软件设计的Box-Behnken试验,以3个因素热风温度、料液进样速度、料液密度为考察对象,以得粉率为响应值来获得喷雾干燥的最优工艺条件。其中得粉率定义为试验设计中产品质量与冷冻干燥条件下产品质量的比值。观察试验过程中有无雾化不均匀、产品粘壁、结块现象;并对制备的样品重量、花色苷含量、水分含量、堆积密度进行测量。试验因素与水平设计见表2。
表2 试验因素与水平设计
Table 2 Factors and levels for orthogonal test
水平 因素A热风温度/℃B进样速度/(mL/min)C料液密度/(g/m L)-1 1 5 0 2 0 1.0 1 0 1 7 0 4 0 1.0 3 1 1 9 0 6 0 1.0 5
1.4.1 扫描电镜
采用冷场发射扫描电子显微镜观察喷雾干燥制备的产品微观结构及其表面形态。
1.4.2 粒径分布
喷雾干燥制备的产品的粒径大小及分布由激光粒度分析仪测定。其中样品分散剂为异丙醇。
1.4.3 感官评价及溶解时间
根据NY/T 1323-2017《中国农业行业标准绿色食品固体饮料标准》,对喷雾干燥制备的产品从色泽、组织形态、滋味和气味方面进行感官评价,并参照QB/T 3623-1999《中国轻工业行业标准果香型固体饮料标准》测定产品溶解时间,即称取25 g产品于500 mL烧杯中,加入200 mL冷开水(10℃),搅拌,计算从加入冷开水到完全溶解的时间(s),全部溶解的时间在60 s内即为符合标准。
1.4.4 速溶粉与干果冲泡效果比较
为比较速溶粉与干果食用的便利性与有效性,称取黑果枸杞速溶粉3 g、黑果枸杞干果3 g、黑果枸杞干果6 g,分别加入100 mL 60℃的饮用水,测定浸泡出花色苷的含量、液体温度随时间的变化情况。
2.1.1 单因素试验结果分析
不同因素对花色苷提取率的影响,见图1。
图1(a)为固定超声功率 400W、料液比 1∶20(g/mL)、提取温度40℃,研究不同提取时间对花色苷得率的影响。可以看出,随着提取时间的延长,花色苷得率逐渐增加,由于花色苷不稳定,易受光照、氧气等因素的影响而发生降解,到达一定提取时间后提取速率小于降解速率而产生花色苷得率下降的结果。
图1 不同因素对黑果枸杞花色苷提取率的影响
Fig.1 The Effect of different factors on Lycium ruthenicum Murr.anthocyanins extraction ratio
a.提取时间;b.提取温度;c.料液比;d.超声功率。
图1(b)为固定超声功率 400W、料液比 1∶20(g/mL)、提取时间50 min,研究提取温度对花色苷得率的影响。随着提取温度的升高,花色苷得率呈下降趋势。花色苷在溶液介质中会随pH值的变化发生结构上的转换,并且结构之间存在着一定的平衡,温度升高会加速水解反应和开环反应使花色苷从有色形式向着无色的查尔酮和甲醇假碱形式转化。因此当温度升高时,花色苷得率下降[22]。
图1(c)为固定超声功率400 W、提取温度20℃、提取时间50 min,研究料液比对花色苷得率的影响。足够的溶剂能够和原料充分接触使得花色苷溶出率增大,但是溶剂过多时花色苷可能发生水解反应,所以出现花色苷得率随着溶剂的增加先上升后下降的现象。
图1(d)为固定料液比 1∶10(g/mL)、提取温度 20 ℃、提取时间50 min,研究超声功率对花色苷得率的影响。Tiwari等[23]研究了超声波处理对红葡萄汁颜色和花色苷提取效果的影响,结果表明超声辅助提取对不同类型的花色苷影响不同,影响较大的是矢车菊素和飞燕草素。在本试验中随着超声功率的增大,花色苷得率先下降后上升,在功率240 W附近产生极低值,这可能由于此频率范围的超声波对黑果枸杞花色苷的结构产生破坏作用,或者此频率范围超声波对黑果枸杞中主要花色苷提取效果影响较小。
2.1.2 正交试验
正交试验设计方案和结果分析如表3所示。
表3 正交试验分析方案及结果
Table 3 Experimental design and results for orthogonal test analysis
次序1∶10 20 30 1 264.1 2 1∶10 30 50 1 242.4 3 1∶10 40 70 1 357.6 4 1∶15 20 50 1 464.6 5 1∶15 30 70 1 229.3 6 1∶15 40 30 1 259.3 7 1∶20 20 70 1 319.2 8 1∶20 30 30 1 279.1 9 1∶20 40 50 1 369.3 K1 3 864.1 4 047.91 3 802.5 K2 3 953.2 3 750.79 4 076.3 K3 3 967.7 3 986.23 3 906.1 k1 1 288.0 1 349.3 1 267.5 k2 1 317.7 1 250.3 1 358.8 k3 1 322.6 1 328.7 1 302.0 R 34.5 99.0 91.3 C提取时间/min 1 A料液比/(g/mL)B提取温度/℃因素 花色苷得率/(mg/100 g)
极差分析结果表明,各因素对花色苷得率的影响大小顺序为B>C>A,即提取温度>提取时间>料液比。比较每个因素对应的K值大小,得出花色苷提取工艺最优组合为 A3B1C2,即当料液比 1∶20(g/mL),提取温度20℃,提取时间50 min时获得最高得率,经3次平行试验,此时黑果枸杞平均花色苷得率为1 473.2 mg/100 g,高于其他组合。
2.2.1 干燥方式比较
取400 mL黑果枸杞提取液,分别用热风干燥、超声干燥、冷冻干燥、喷雾干燥4种干燥方式对其干燥,不同干燥方式对产品物理性状及花色苷含量的影响如表4所示。
以冷冻干燥所得产品质量为标准,任何一种干燥方式的最终质量跟冷冻干燥质量的比值为该干燥方式的产率。提取液浓缩处理后,经热风干燥、超声干燥、冷冻干燥仍耗时较久,而喷雾干燥用时短,所得样品无需粉碎,粉质松软,色泽美观;由于喷雾干燥前提取液未浓缩处理,因此喷雾干燥产品花色苷含量高于冷冻干燥及其他干燥方式,但产率相对较小。综合考虑时间与成本,优选喷雾干燥为黑果枸杞水提物的干燥方式。
表4 干燥方式比较
Table 4 Comparison of four dry ways
干燥方式时间粉碎难易酥脆程度颜色产率/%花色苷含量/(mg/100 g)热风干燥 3 d 易 酥脆 褐 99.5 0超声干燥 2 d 较易 较酥脆 紫黑 98.9 1 077.3冷冻干燥 2 d 易 酥脆 黑 100.0 1 115.3喷雾干燥 20 min 无需粉碎 软 紫 87.0 1 205.8
2.2.2 喷雾干燥工艺优化
响应面方案及结果与如表5所示。
表5 响应面分析方案及结果
Table 5 Experimental design and results for response surface analysis
试验次序 A B C 得粉率/%体积密度/(g/cm3)1 0 0 0 74.6 1 341.5 2.5 0.382 7 2 -1 0 1 76.0 1 360.4 2.7 0.323 7 3 0 0 0 85.5 1 367.3 2.3 0.255 6 4 -1 -1 0 86.5 1 360.2 2.1 0.265 1 5 0 -1 1 89.2 1 415.9 1.7 0.315 2 6 0 0 0 79.5 1 434.2 2.5 0.257 2 7 0 1 1 60.5 1 474.6 3.7 0.363 9 8 -1 0 -1 87.0 1 471.5 2.6 0.287 9 9 1 0 1 76.5 1 459.4 2.0 0.350 5 10 0 0 0 80.7 1 390.8 2.0 0.311 3 11 -1 1 0 65.7 1 376.5 3.5 0.341 7 12 1 1 0 61.5 1 412.6 2.6 0.311 1 13 0 1 -1 75.1 1 514.8 3.9 0.330 7 14 0 0 0 76.4 1 401.7 2.7 0.318 7 15 1 -1 0 88.9 1 434.1 1.8 0.292 7 16 1 0 -1 89.0 1 636.3 2.1 0.298 1 17 0 -1 -1 97.0 1 517.6 2.2 0.272 2花色苷含量/(mg/100 g)水分含量/%
应用Design-Expert 8.05软件对表5中数据进行二次多元回归拟合和响应面分析,得出方差分析表6和响应面曲面图2。
表6 方差分析
Table 6 Analysis of variance
注:*为差异显著,P<0.05;**为差异极显著,P<0.01。
方差来源 平方和 自由度 均方 F P 显著性模型 1 598.27 9 177.59 16.88 0.000 6 **A 0.050 1 0.050 4.745×10-3 0.947 0 B 1 221.76 1 1 221.76 116.15 <0.000 1 **C 262.41 1 262.41 24.95 0.001 6 **AB 11.25 1 11.25 1.07 0.335 4 AC 0.59 1 0.59 0.056 0.819 4 BC 11.35 1 11.35 1.08 0.333 5 A2 4.31 1 4.31 0.41 0.542 3 B2 30.47 1 30.47 2.90 0.132 5 C2 60.85 1 60.85 5.78 0.047 1 *残差 73.63 7 10.52失拟项 3.26 3 1.09 0.062 0.977 3 不显著纯误差 70.37 4 17.59总差 1 671.90 16 R2 0.956 0 R2adj 0.899 3
由表6可以看出,回归方程的P<0.01,表明该回归模型达到极显著水平。失拟项不显著,表明方程对试验拟合良好,可用于黑果枸杞水提物喷雾干燥得率的预测。一次项B、C对试验结果影响极显著;二次项C2对试验结果影响显著;一次项A、交互项对试验结果影响不显著。综合回归模型分析结果,可确定最佳工艺参数为:进风温度190℃,进样速度20 mL/min,料液密度1.01 g/mL,在此条件下预测速溶粉得率为97.98%,而实测值为97.32%,该实际值与预测值大小相近,因此利用响应面法优化所得的工艺条件具有可行性。
图2 各因素对黑果枸杞速溶粉得率的交互影响
Fig.2 Response surface showing the interaction of various factors on the extraction yield of Lycium ruthenicum Murr.instant powder
另外对表5中产品得率、产品水分含量等指标进行分析。7、11、13号样品(进样速度为60 mL/min,得粉率分别为60.5%、65.7%、75.1%)喷雾干燥过程中喷头滴液,且所得产品水分含量偏高(分别为3.7%、3.5%、3.9%),这是由于进样速度过快,导致样品受热不充分,水分来不及被热风蒸发带走,使得产品水分含量较高,这也直接导致产品较黏而粘在干燥塔内壁影响产率。如果适当提高进风温度则可以降低产品的水分含量(对比11、12号样品)。2、9号样品由于密度过大(密度为1.05 g/mL),干燥时出现雾化不均匀的现象。本次试验采用离心式喷雾干燥法,由于黑果枸杞多糖本身具有一定的黏度,另外如果进样样品密度大,雾化器无法充分将样品散成很微小的液滴导致雾化不均匀现象的发生,雾化不均匀不仅会影响产品颗粒的均匀性,还会造成部分料液无法干燥成粉。通过调节喷雾干燥环节的料液进样速度、进风温度,在保证干燥速率的同时还可以降低产品含水量,避免干燥不充分而导致得粉率下降。通过控制料液的密度来减少雾化不均匀现象的发生,从而保证产品颗粒的均匀性和较高的得粉量。经验证,优化条件下的黑果枸杞速溶粉有较高的得率(97.32%),因此采用响应面优化喷雾干燥工艺可提高产品的得率,提升产品在含水量、颗粒均匀性等方面的品质。
通过多元回归拟合分析得到黑果枸杞速溶粉得率(Y)与进风温度(A)、进样速度(B)、料液密度(C)之间的二次多项回归方程:Y=10 026.70+2.02A+9.94B-19 532.32C-8.39×10-3AB-0.96AC-8.42BC-2.53×10-3A2-0.03B2+9 503.78C2
2.3.1 扫描电镜及粒径分布
黑果枸杞速溶粉扫描电镜和粒径分布见图3。
图3 黑果枸杞速溶粉扫描电镜和粒径分布
Fig.3 Scanning electron microscope image and particle size distribution of Lycium ruthenicum Murr.instant powder
通过图3(a)可以看出其样品在喷雾干燥过程中形成了空腔结构,空腔结构为其速溶性提供了结构基础;粒径分布图(b)为一单一峰,未出现多峰,粒径较为均一。激光粒度分析仪结果显示粒径范围4 μm~60 μm,平均粒径17 μm,这与黑果枸杞水提物的成分及喷雾干燥过程的参数有关。
2.3.2 感官评价及溶解时间
经观察,制备的产品呈紫黑色,无结块,冲溶后为均匀混悬液,无肉眼可见的杂质,具有特殊的香甜气味,无刺激、酸败、焦糊等异味,符合中国农业行业标准绿色食品固体饮料感官规定。3次平行试验平均基本溶解时间为32.1 s,平均完全溶解时间为43.4 s,小于行业标准溶解时间60 s,达到了中国轻工业行业标准果香型固体饮料溶解时间标准。
2.3.3 速溶粉与干果冲泡效果比较
不同样品随着时间延长花色苷浸出量以及水温变化见图4。
图4 不同样品随着时间延长花色苷浸出量以及水温变化
Fig.4 The changes in water temperature and the anthocyanin leaching content of different samples with time
从图4可以看出黑果枸杞速溶粉在冲泡的瞬间其活性成分花色苷已几乎完全溶解,而浸泡干果方式花色苷溶出速度较慢。两倍速溶粉质量的干果浸泡50分钟后其花色苷含量仅达到速溶粉冲泡初期的53.0%,并且溶液温度已降至28℃,远远低于人们正常用水的温度。干果3、6 g浸泡6小时后,溶液中的可溶性固形物含量分别为1.029 3、2.001 5 g,为干果质量的34.3%、33.4%,仍有大量的成分滞留在果实内,所以速溶粉具有显著的饮用优势。
黑果枸杞作为为我国西部特有的植物品种,正日益受到消费者喜爱,其研究和开发也在逐步深入。本研究利用超声辅助水提黑果枸杞花色苷,并采用响应面设计优化喷雾干燥工艺,制得黑果枸杞速溶粉,后探讨了黑果枸杞速溶粉微观结构、粒径分布及溶解时间。经正交优化,在超声功率400 W条件下,黑果枸杞花色苷的最佳水提工艺为料液比1∶20(g/mL)、提取时间50 min、提取温度40℃。喷雾干燥最佳工艺为进风温度190℃,进样速度20 mL/min,料液密度1.01 g/mL,在此条件下预测速溶粉得率为97.98%,实测值为97.32%,与预测值大小相近,响应面法优化工艺条件具有可行性。通过优化喷雾干燥工艺参数可降低产品含水量,减少雾化不均匀现象的发生,从而提高了产品的品质与得率。经表征,制得的速溶粉是空腔结构,粒径分布较为均一,粒径范围为4 μm~60 μm,平均粒径17 μm,并达到了溶解时间标准。由于花色苷的不稳定性,极易受外界环境的影响而发生降解,所以在黑果枸杞速溶粉制备过程中不可避免地出现花色苷含量降低的现象。本次研究采用超声水提、无辅料添加更为安全、环保、健康的方式,将黑果枸杞以一种新的形式呈现出来,可扩大其在食品、保健品及医药等领域的应用。
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