珊瑚树（Viburnum odoratissimum）是忍冬科（Caprifoliaceae）荚蒾属（Viburnum Linn.）植物，常绿灌木或小乔木，始载于《中国高等植物图鉴》。珊瑚树具有较强耐火性[1]和抗寒性[2]，对城市空气中颗粒污染物滞尘量高，是广受欢迎的绿化树种[3]。已有研究表明珊瑚树中主要含有二萜、三萜、黄酮、倍半萜等化合物[4-6]。其枝叶可入药，有通经活络功效，主治风湿痹痛、跌打肿痛、骨折[7]。长期以来，对珊瑚树的研究主要集中在园林绿化、抗寒以及化学成分等方面。其天然产物和药用价值未被充分开发，而关于珊瑚树中原花青素的研究鲜见报道。
原花青素（proanthocyanidins，PC）是一种分子结构特殊的生物类黄酮，由不同数量的儿茶素或表儿茶素缩合而成，是目前发现的效果最好的自由基清除剂之一，以高效、低毒、高生物利用率著称，在食品、化妆品、医药等领域应用广泛[8-10]。原花青素的提取方法主要有溶剂萃取法[11]、超声辅助提取法[12-13]、酶法提取法[14]等。超声波辅助提取原花青素具有时间短、操作简单、提取率高等优点而备受关注。赵春艳等[15]在山楂果中提取原花青素，采用微波法提取率是传统方法的2倍。贾宝珠等[16]以香蕉皮为原料，分别采用溶剂提取法和超声波辅助提取法对原花色素的提取工艺进行研究，结果表明超声波辅助提取法的最佳提取时间仅为溶剂提取法的40%，得率和纯度却分别为溶剂提取法的1.5倍和1.6倍。
该课题组前期研究发现，珊瑚树韧皮部和叶片中富含原花青素（乙醇一次性提取率达到18.32%和18.59%），高于已有报道，张晓娟等[17]以超声辅助提取葡萄皮中原花青素得率为8.02%；公云等[11]在茄皮中原花青素提取率为10.46%；赵文娟等[18]测得黑果枸杞原花青素提取率4.32%。因此，为了拓展珊瑚树资源利用潜力，本研究拟以乙醇为提取剂，采用超声波辅助提取法提取珊瑚树叶片中原花青素，利用响应面分析法筛选最优工艺，以期为珊瑚树叶中原花青素的进一步开发及利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
珊瑚树：西北农林科技大学校园。经西北农林科技大学生命科学学院吴振海副教授鉴定为忍冬科荚蒾属植物珊瑚树。取新鲜完全展开的功能叶片，烘箱45℃烘干，粉碎后过80目筛，于-20℃保存备用。
1.2 仪器与试剂
UV-1700紫外-可见分光光度计：日本岛津；SB25-12DTD超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；HC-3618R离心机：安徽中科中佳科学仪器公司；乙醇、甲醇、盐酸、硫酸、香草醛均为分析纯：西陇化工股份有限公司；葡萄籽原花色素标准品（纯度95%）：上海源叶生物科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 珊瑚树叶片原花青素提取工艺流程
拣选成熟完整珊瑚树叶片→烘干（45℃）→粉碎（过80目筛）→提取→离心→原花青素粗提液
选取完整的珊瑚树成熟叶片，清水冲洗后檫干，置45℃烘箱中烘至恒重，再用粉碎机粉碎，过80目筛，得珊瑚树叶片粉末。在超声频率40 kHz下，考察不同乙醇浓度（60%、70%、80%、90%、100%）、料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]、提取时间（20、30、40、50、60 min）对珊瑚树叶片中原花青素提取率的影响。
1.3.2 原花青素定量分析
利用改良的香草醛-盐酸比色法[19]对原花青素进行定量分析。分别配制1 g/100 mL的香草醛-甲醇溶液及1 mol/L的盐酸-甲醇溶液，临用时将二者按体积比1∶1充分混匀，即制得比色工作液。称取葡萄籽原花青素分析标准品，以甲醇溶解，配制成质量浓度为0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mg/mL 的标准溶液，然后分别取100 μL上述标准溶液，加入3 mL的比色工作液，混匀，室温条件下反应30 min，以甲醇调零，测定500 nm波长处的吸光度（A500nm）值，绘制 A500nm（Y）与葡萄籽原花青素标准品质量浓度（X）的标准曲线见图1，得到回归方程：Y=0.273 2X（R2=0.994），各样品以同法测定，含量由回归方程计算，然后计算原花青素提取率[20]。
图1 原花青素标准曲线
Fig.1 Standard curve of proanthocyanidins
1.3.3 单因素和响应面设计试验
在其他条件相同的条件下，分别研究乙醇浓度（60%、70%、80%、90%、100%），料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）]和超声时间（20、30、40、50、60 min）3个单因素对原花青素提取率的影响。在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，以原花青素提取率为响应值，进行三因素三水平的响应面分析。
1.3.4 数据统计
采用Excel 2003和Design-Expert 8.0.6软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇浓度对珊瑚树叶中原花青素提取率的影响
在料液比1∶30（g/mL），超声时间37 min条件下，考察不同乙醇浓度对原花青素提取率的影响见图2。
图2 乙醇浓度对原花青素提取率的影响
Fig.2 Effcect of ethanol concentration on the extraction rate of proanthocyanidins
由图2可知，随着乙醇浓度增加原花青素提取率增加，90%乙醇浓度下提取率达到最大值18.59%，100%浓度乙醇提取率最低。这可能与原花青素极性有关，因此选择90%作为最佳乙醇提取浓度。
2.1.2 料液比对珊瑚树叶中原花青素提取率的影响
图3 料液比对原花青素提取率的影响
Fig.3 Effcect of solid-liquid ratio on the extraction rate of proanthocyanidins
料液比对原花青素提取率的影响见图3。如图3所示，珊瑚树叶中原花青素提取率随料液比变化呈现先增加后减少趋势，表明溶剂量较小时候原花青素提取不完全，在料液比1∶30（g/mL）条件下原花青素提取率最高，随后溶剂量增加原花青素提取量降低，因此选择料液比1∶30（g/mL）作为最适料液比条件。
2.1.3 超声时间对珊瑚树叶中原花青素提取率的影响
珊瑚树叶中原花青素提取率随超声时间变化如图4所示。
图4 超声时间对原花青素提取率的影响
Fig.4 Effcect of ultrasonic time on the extraction rate of proanthocyanidins
呈现先增加后减少的变化趋势，这可能是因为时间短原花青素未能充分提取，而时间过长导致原花青素酚羟基结构破坏，提取率反而下降，因此，选取40 min作为超声提取原花青素的最佳时间。
2.2 响应面试验结果及分析
2.2.1 响应面试验设计与结果分析
根据单因素试验所确定的各因素水平，进行Box-Benhnken中心组合的试验设计，试验因素和水平设计如表1所示。
表1 响应面试验因素及水平
Table 1 Variables and levels of response surface design
水平A乙醇浓度/%B料液比/（g/mL）C超声时间/min-1 80 1∶40 30 0 90 1∶30 40 1 100 1∶20 50
在单因素试验的基础上，根据Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken设计响应面试验，其中1号～12号为析因点，13号～17号为零点，是区域的中心点，用来估计试验误差。珊瑚树叶原花青素提取率为响应值，响应面试验设计方案及结果见表2。
表2 原花青素提取得率响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface analysis for the optimization of extraction conditions of PC
序号 乙醇浓度/%花青素提取率/%1 100 1∶30 30 4.37 2 90 1∶40 30 15.28 3 100 1∶30 50 6.06 4 80 1∶40 40 15.63 5 90 1∶20 50 14.42 6 80 1∶30 50 14.95 7 100 1∶40 40 6.64 8 100 1∶20 40 5.40 9 80 1∶30 30 15.37 10 90 1∶20 30 13.58 11 90 1∶40 50 15.04 12 80 1∶20 40 14.37 13 90 1∶30 40 15.65 14 90 1∶30 40 15.63 15 90 1∶30 40 15.23 16 90 1∶30 40 14.79 17 90 1∶30 40 15.32料液比/（g/mL)超声时间/min
2.2.2 模型的建立与显著性分析
利用Design-Expert 8.0.6软件，建立提取溶液乙醇浓度、液料比及超声时间三因子数学回归模型为：R1=15.32-4.73×A-0.60×B+0.23×C+0.005×AB+0.53×AC+0.27×BC-4.60×A2-0.21×B2-0.53×C2
对二次方程进行方差分析见表3。
结果表明：A、B、AC、A2、C2因素对原花青素提取率影响显著，表明这3个因素对原花青素提取率均有影响；其中乙醇浓度和超声时间的交互作用也会对原花青素提取率有显著影响。进一步分析方程方差可知，二次多项的回归项P值＜0.000 1，差异极显著（P＜0.01），失拟项 P 值为 0.360 7，不显著（P＞0.05）。所以该模型的拟合度较高，可以用于对二次回归方程的相应值进一步预测；此外，该模型的决定系数R2=0.996 3，表明预测值与真实值有较高的相关性；而变异系数C.V.=2.98，说明试验可操作性较好。R2=0.966 9和R2Adj=0.991 6说明模型可以解释99.16%响应值的变化，只有总变异的0.84%不可以用此模型解释，说明该模型的拟合度较好。
表3 二次回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance the regression model
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值模型 276.63 9 30.74 211 ＜0.000 1 A乙醇浓度 179.08 1 179.08 1 229.33 ＜0.000 1 B料液比 2.90 1 2.90 19.94 0.002 9 C时间 0.44 1 0.44 3.00 0.126 8 AB 1.00×10-4 1 1.00×10-4 6.87×10-4 0.979 8 AC 1.11 1 1.11 7.64 0.027 9 BC 0.29 1 0.29 2.00 0.200 A2 89.22 1 89.22 612.48 ＜0.000 1 B2 0.19 1 0.19 1.28 0.294 5 C2 1.20 1 1.20 8.22 0.024 1残差 1.02 7 0.15失拟项 0.53 3 0.18 1.42 0.360 7纯误差 0.49 4 0.12总离差 277.65 16
综上述分析可知，此模型可以用来分析和预测珊瑚树叶片中原花青素提取率的真实情况。3种因子对原花青素提取率的影响程度为：A＞B＞C，即乙醇浓度＞料液比＞超声时间。
2.2.3 响应面交互作用分析
响应面曲面图直观地反映乙醇浓度、料液比和超声时间对原花青素提取率的影响如图5～图7所示。
对比图5～图7，乙醇体积分数对原花青素提取率影响最大，表现为图5、图6的曲面较陡；其次是液料比；超声时间表现为响应面相对较为平缓，说明其对原花青素提取率影响较小。响应面图投影面为等高线图，等高线的形状可反映出各因素交互作用的强弱，由等高线形状分析，除乙醇浓度与超声时间的交互因素较强外（图6），其余各因素间的交互作用不强，表现为其等高线椭圆形状不明显，这与回归方程的方差分析结果相一致。
图5 乙醇浓度和料液比对珊瑚树原花青素提取影响的响应面图与等高线图
Fig.5 The response surface plot and contour plot for extracting the PC from the Viburnum odoratissimum under alcohol concentration and solid-liquid ratio
图6 乙醇浓度和超声时间对珊瑚树原花青素提取影响的响应面图与等高线图
Fig.6 The response surface plot and contour plot for extracting the PC from the Viburnum odoratissimum under alcohol concentration and the ultrasonic time
图7 超声时间和料液比对珊瑚树原花青素提取影响的响应面图与等高线图
Fig.7 The response surface plot and contour plot for extracting the PC from the Viburnum odoratissimum under the ultrasonic time and solid-liquid ratio
2.2.4 最优工艺条件及验证试验
为验证响应面法所得结果的可靠性，对模型优化的工艺条件进行验证。选择工艺参数：乙醇浓度85%、料液比1∶40（g/mL）、超声时间37 min，进行试验3次，3次验证试验原花青素提取率平均值为16.92%，RSD值为1.29%，且与模型预测值16.98%非常接近，说明方程与真实试验情况拟合较好，试验得到的优化参数是稳定可靠的。
3 结论
以响应面分析法对珊瑚树叶中原花青素进行超声辅助提取工艺优化，拟合了乙醇浓度、料液比、超声时间三个因素对原花青素提取率影响的回归模型，分析认为各因素对提取率的影响大小顺序为：乙醇浓度＞料液比＞超声时间。得到最佳工艺参数为：乙醇浓度 85%，料液比 1 ∶40（g/mL）、超声时间 37 min。在此条件下，原花青素提取率为16.92%，与预测值接近，其相对误差为1.29%，说明试验优化得到的技术参数可靠。该条件下得到的原花青素提取率16.92%介于单因素试验中乙醇浓度80%的提取率（14.16%）和90%的提取率（18.59%）之间，也印证了乙醇浓度是影响提取率的最重要因素的结论。采用超声辅助提取珊瑚树叶中的原花青素，提取率高，操作简单，为珊瑚树叶中原花青素的进一步开发利用提供依据。
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