荔枝，因杨贵妃喜食而闻名天下，原产我国南方，广西地区也有大面积种植。每年的六至七月是荔枝集中上市的季节，其中的香荔，果肉色白温润，质脆清甜，香气浓郁，尤受消费者的喜爱。荔枝富含多种人体必需的氨基酸及微量元素[1]，不仅可以鲜食还可入药，据中医记载，荔枝，性温和，果肉安神温中、理气补血、健脾益心[2]。荔枝核则是人们食用荔枝之后的剩余物。香荔的核较大，占据荔枝总重的近四分之一。目前荔枝核的利用率极低，少部分用于积肥或燃料，大部分则以垃圾形式直接舍弃。
荔枝核在药理方面与荔枝肉有相似的功效，现代药理学亦证实，荔枝核中含有丰富的多糖、多酚及黄酮等天然化合物[3-5]。多糖是目前研究较多的一类天然有机化合物，具有降血糖、降血脂、抗衰老、调节机体免疫能力等重要的生理活性[6-10]，被称为生命活动中的“生物反应调节剂”，是保健类食品及药物的重要来源，如已实现工业化的菊粉（菊芋多糖）[11]。因此，从荔枝核中提取多糖，变废为宝，实现荔枝的综合开发利用，具有重要的现实意义。
多糖的提取方法较多，为了进一步提高提取效率，在普通提取方式的基础上增加了超声波辅助、微波辅助、酶解等方法[12-15]。其中，超声波辅助提取可以在不破坏多糖结构及性质的前提下明显缩短提取时间[16-17]。因此，本文采用超声波辅助热水浸提法提取香荔核中的多糖，响应面法优化，并对多糖的生物活性进行体外测试，从而为香荔核的开发及应用提供一定的数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
荔枝（香荔）：百色市右江区城西大型农产品批发市场；三氯乙酸、铁氰化钾、葡萄糖、邻苯三酚、三羟基氨基甲烷（分析纯）：麦克林生化试剂有限公司；乙醇、浓硫酸、苯酚、水杨酸、过氧化氢、浓盐酸、磷酸、三氯化铁（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
高功率数控超声波清洗器（KQ-202KDB）：超声波仪器有限公司；紫外可见分光光度仪（UV-2800）：上海美普达仪器有限公司；恒温水浴振荡器（SHA-B）：常州国华电器有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG-1）：上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 样品处理
香荔去皮去肉取核，60℃干燥至恒重。粉碎，过60目筛，收集荔枝核粉末样品于自封袋中，置于冰箱保鲜格中避光保存，备用[18]。
1.2.2 绘制标准曲线
葡萄糖基准物干燥至恒重，精准配制0.500 0 mg/mL葡萄糖标准溶液。准确移取葡萄糖标准溶液2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，定容至 100 mL，配制 10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 μg/mL 系列待测溶液。准确移取上述不同浓度的葡萄糖待测液各1.00 mL至干燥的试管中，依次加入蒸馏水2.00 mL、5.0%苯酚溶液1.50 mL、98%浓硫酸7.50 mL，混合均匀后40℃恒温反应30 min，取出，冷却至室温，于491 nm处测定体系吸光度。以吸光度A对葡萄糖浓度c（μg/mL）进行线性回归，回归方程为：A=0.0139 3c+2.300 × 10-3，R2=0.999 8。
1.2.3 多糖的提取及测定
在干净的圆底烧瓶中按一定比例加入香荔核粉末样品及蒸馏水，置于超声波提取器中提取，反复3次。合并提取液，Sevag法去蛋白，过滤。浓缩，残液离心，取上清液定容至100 mL，备用。如1.2.2所示测定体系吸光度，计算多糖含量，求取多糖提取率[19-21]。
1.2.4 单因素试验
准确称取香荔核粉末样品1.000g，执行1.2.3所示多糖提取流程，固定其它因素及水平：液料比25∶1（mL/g），超声时间20 min，超声功率800 W，考察不同温度40、50、60、70、80、90 ℃对多糖提取效果的影响情况[22-24]；固定其它因素及水平：提取温度50℃，超声时间20 min，超声功率 800 W，考察不同液料比 10 ∶1、15∶1、20 ∶1、25∶1、30 ∶1、35∶1（mL/g）对多糖提取效果的影响情况；固定其它因素及水平：液料比25∶1（mL/g），提取温度50℃，提取时间20 min，考察不同超声功率400、500、600、700、800、900 W 对多糖提取效果的影响情况；固定其它因素及水平：液料比25∶1（mL/g），提取温度50℃，超声功率800 W，考察不同超声时间5、10、15、20、25、30 min对多糖提取效果的影响情况。
1.2.5 香荔核多糖提取工艺的响应面优化
参考单因素试验的考察结果，设立多糖提取率为响应值（Y），提取温度（A）、液料比（B）及超声功率（C）为自变量，截取任一因素中3个对多糖提取率具有显著影响效果的水平，利用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken法对多糖提取工艺进行响应面优化设计[25-27]，试验因素与水平设计见表1。
表1 响应面优化试验设计因素与水平表
Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design
水平 因素A提取温度/℃B液料比/（mL/g）C超声功率/W-1 50 15 500 0 60 20 600+1 70 25 700
1.2.6 香荔核多糖抗氧化活性的体外测试
1.2.6.1 香荔核多糖对·OH（羟基自由基）清除效果的测定
分别向5支干净试管中依次加入9.000 mmol/mL硫酸亚铁溶液1.00 mL、9.000 mmol/mL水杨酸-乙醇溶液1.00 mL、蒸馏水1.00 mL、8.800 mmol/mL过氧化氢溶液1.00 mL、不同浓度的待测多糖溶液各1.00 mL。混合均匀，37℃恒温反应1 h，514 nm处测定体系吸光度Ax。固定其它条件及操作流程，以蒸馏水取代过氧化氢溶液，测定对照吸光度A1；以蒸馏水取代待测多糖溶液，测定空白吸光度A0，香荔核多糖对·OH的清除率按如下公式进行计算[28]：
对·OH 的清除率 η/%=[A0-（Ax-A1）]/A0×100
1.2.6.2 香荔核多糖对O2-·（超氧阴离子自由基）清除效果的测定
分别向5支干净试管中依次加入pH=8.2TriS-HCl缓冲溶液2.25 mL、10.00 mmol/L邻苯三酚溶液30.00 μL、不同浓度待测多糖溶液0.50 mL，混合均匀，室温反应20 min，325 nm处4 min内每30秒测定一次体系吸光度，计算有多糖存在时的邻苯三酚自氧化速率Ax。固定其他条件及试验流程，以蒸馏水取代待测多糖溶液，计算无多糖存在时的邻苯三酚自氧化速率A0，香荔核多糖对O2-·的清除率按如下公式进行计算[29]：
对 O2-·的清除率 η/%=（A0-Ax）/A0×100
1.2.6.3 香荔核多糖总还原力的测定
分别向5支干净试管中依次加入不同浓度待测多糖溶液1.00 mL、pH=6.6磷酸缓冲溶液2.50 mL、1%铁氰化钾溶液2.50 mL，混合均匀，50℃恒温反应25 min。取出，冷却至室温，继续加入10%三氯乙酸溶液2.50 mL，3 000 r/min恒速离心10 min。取上清液2.50 mL，依次加入蒸馏水2.50 mL、0.1%三氯化铁溶液1.00 mL，混合均匀后室温反应10 min，700 nm处测定体系吸光度Ax。固定其他条件及试验流程，以蒸馏水取代铁氰化钾溶液，测定对照吸光度A1；以蒸馏水取代待测多糖溶液，测定空白吸光度A0，香荔核多糖的总还原力按如下公式进行计算[30]：
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 香荔核多糖提取率随提取温度变化的趋向
体系温度可以明显影响分子运动的剧烈程度。香荔核多糖提取率随提取温度变化的趋向见图1。
图1 香荔核多糖提取率随提取温度变化的趋向
Fig.1 The trend of polysaccharides’extraction from semen litchi based on temperature
如图1所示，温度在较低范围时，多糖分子运动能力随体系温度升高而加强，多糖提取率提高且增速显著，当体系温度设定在60℃时，提取率达到最大值10.84%。多糖分子作为一种有机分子对温度变化较为敏感，在高温下易失去生物活性以沉淀形式析出导致多糖提取率下降。因此提取温度设定在60℃比较合适。
2.1.2 香荔核多糖提取率随液料比变化的趋向
溶剂量较多时，体系扩散压较大，有利于多糖分子向外扩散。香荔核多糖提取率随液料比变化的趋向见图2。
如图2所示，初始阶段，多糖提取率随液料比增大而提高，当液料比设定为25∶1（mL/g）时，多糖提取率达到最大值10.45%。过度增大液料比使得溶剂用量增速快于多糖提取率增速，不仅造成溶剂浪费，亦会导致样品中其它杂质成分溶出。综合考虑提取效率及后续浓缩工作，本着节约的原则，液料比设定在25 ∶1（mL/g）比较合适。
图2 香荔核多糖提取率随液料比变化的趋向
Fig.2 The trend of polysaccharides’extraction from semen litchi based on liquid-material ration
2.1.3 香荔核多糖提取率随超声功率变化的趋向
超声波能够提高提取效率主要在于其可以破碎细胞壁加快多糖分子的溶出。香荔核多糖提取率随超声功率变化的趋向见图3。
图3 香荔核多糖提取率随超声功率变化的趋向
Fig.3 The trend of polysaccharides’extraction from semen litchi based on ultrasonic power
超声时间一定时，如图3所示，随着超声功率增强，细胞壁破碎效果愈佳，多糖分子充分溶出，提取率上升。当超声功率设定在700 W时，多糖提取率达到最大值10.64%。超声功率进一步增大，多糖分子受过强的机械作用及空化效应影响其稳定性下降，可能水解生成寡聚糖甚至单糖，提取率下降。综合考虑试验后续处理及能源节约，超声功率设定在700 W比较合适。
2.1.4 香荔核多糖提取率随超声时间变化的趋向
细胞壁破碎效果越好，多糖分子越容易溶出。香荔核多糖提取率随超声时间变化的趋向见图4。
图4 香荔核多糖提取率随超声时间变化的趋向
Fig.4 The trend of polysaccharides’extraction from semen litchi based on ultrasonic time
当超声功率一定时，由图4所示，随着时间延长，细胞壁被充分破碎，有利于多糖分子从样品中溶出并向外扩散，多糖提取率上升。当超声时间设定在20 min时，多糖提取率达到最大值10.27%。超声时间过长，多糖分子运动加剧产生较多热量，多糖的糖苷键吸收足够热量并在超声波作用下发生断裂转化为寡糖导致提取率下降。因此超声时间设定在20 min时比较合适。
2.2 香荔核多糖提取工艺的响应面优化结果
2.2.1 响应面优化试验设计及数据分析
在提取香荔核多糖的单因素试验考察中发现，多糖提取率随超声时间变化波动比较平缓，说明超声时间的影响不显著，为4个考察因素中的次要因素。因此，设立多糖提取率为响应值（Y），以提取温度（A）、液料比（B）、超声功率（C）三因素为自变量，利用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平优化试验，安排并严格实施17个试验点的回归试验，试验方案及结果如表2所示。
表2 响应面优化试验设计安排及试验结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
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续表2 响应面优化试验设计安排及试验结果
Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis
试验号 A B C Y/%12 0 0 0 10.61 13 -1 +1 0 10.61 14 -1 -1 0 9.96 15 0 -1 +1 10.52 16 0 0 0 10.73 17 -1 0 -1 9.98
2.2.2 回归方程的方差分析及显著性检验
利用Design-Expert 8.0.6软件程序统计分析表2中展示的试验结果，对各个因素进行回归拟合，得到多糖提取率（Y）对提取温度（A）、液料比（B）、超声功率（C）的三元二次回归方程：
对所建立的香荔核多糖提取工艺回归模型进行方差分析，结果如表3所示。
表3 回归模型的方差分析表
Table 3 Analysis of varlance of regression model
注：** 表示 p＜0.01，极显著。
因素 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性模型 1.17 9 0.13 33.14 ＜0.000 1 **A 0.039 1 0.039 10.00 0.015 9 B 0.15 1 0.15 39.28 0.000 4 **C 0.27 1 0.27 68.89 ＜0.000 1 **AB 0.16 1 0.16 40.81 0.000 4 **AC 0.017 1 0.017 4.31 0.076 5 BC 0.060 1 0.060 15.31 0.005 8 **A2 0.15 1 0.15 38.46 0.000 4 **B2 0.048 1 0.048 12.24 0.010 0 C2 0.23 1 0.23 57.68 0.000 1 **残差 0.027 7 3.92×10-3失拟项 0.015 3 5.108×10-3 1.69 0.306 3纯误差 0.012 4 3.030×10-3总和 1.20 16 R2=0.977 1 R2Adj=0.947 6
该模型p＜0.000 1，极显著；失拟项p=0.306 3＞0.05，不显著，说明除考察因素外，试验过程不受其它因素影响或影响可忽略，残差主要由随机误差引起。决定系数R2=0.977 1、R2Adj=0.947 6，说明该回归模型与实际试验过程匹配程度高，可行，因此可以利用该回归模型分析及预测试验过程中多糖提取率随因素、水平变化的波动情况。
3个优化设计因素中，提取温度的二次项A2（p=0.000 4）、液料比 B（p=0.000 4）、超声功率 C（p＜0.000 1）及其二次项C2（p=0.000 1）对香荔核多糖提取率的影响均为极显著水平（p＜0.01），且三因素的主次顺序为：超声功率＞液料比＞提取温度。同时，3个优化设计因素之间的交互作用中，交互作用 AB（p=0.000 4）、BC（p=0.005 8）对多糖提取的影响极显著，交互作用AC（p=0.076 5）的影响不显著。
2.2.3 多糖提取率随交互作用变化的趋向响应面分析图
依据该回归模型的方差分析，利用Design-Expert 8.0.6软件绘制出多糖提取率与三优化设计因素之间交互作用的响应面分析图，结果见图5～图7。
图5 香荔核多糖提取率随交互作用AB变化的趋向响应面分析图
Fig.5 Response surface of polysaccharides’extraction trend from semen litchi affect by interactive AB
图6 香荔核多糖提取率随交互作用AC变化的趋向响应面分析图
Fig.6 Response surface of polysaccharides’extraction trend from semen litchi affect by interactive AC
图7 香荔核多糖提取率交互作用BC变化的趋向响应面分析图
Fig.7 Response surface of polysaccharides’extraction trend from semen litchi affect by interactive BC
比较图5、图6、图7可以发现，交互作用AB、BC的响应曲面具有显著的陡坡，而交互作用AC的响应曲面相对平滑。相关因素对多糖提取效果影响的显著性与响应面的陡峭程度成正比，可知，交互作用AB、BC可以极为显著地影响多糖的提取效果。等高线图中，中心图形椭圆率越高说明该因素的影响效果越显著。图5、图6、图7中，交互作用AB、BC中心椭圆率明显高于交互作用AC，说明交互作用AB、BC对多糖提取率的影响显著强于交互作用AC。
2.2.4 香荔核多糖最佳提取工艺参数的确定及试验验证
经过Design-Expert 8.0.6对响应面优化试验数据的回归分析，确定最佳提取工艺条件：提取温度57.48℃，液料比为 23.76∶1（mL/g），超声功率 623.3 W，在该条件下进行试验，香荔核多糖的提取率可达10.72%。检验响应面优化回归模型的准确性，在方便操作的基础上，调整工艺参数：提取温度58℃，液料比为 24 ∶1（mL/g），超声功率 620 W，超声时间 20 min，严格执行该条件，平行试验5次，实测多糖平均提取率为10.04%，接近预测值10.72%，说明该回归模型可行，具有较好的应用价值。
2.3 香荔核多糖抗氧化活性的体外测试结果
2.3.1 香荔核多糖对·OH清除效果的测定
·OH是生命体中产生的最具氧化性能的自由基。多糖分子中含有的大量活性氢原子可湮灭·OH，从而消除·OH对内脏器官的危害。香荔核多糖对·OH清除效果随浓度变化的趋向见图8。
图8 香荔核多糖对·OH清除效果随浓度变化的趋向
Fig.8 The scavenging trend of polysaccharides from semen litchi on·OH
由图8可知，香荔核多糖对·OH具有较好的清除效果，且清除率增速随多糖浓度的增加显著加快，当多糖浓度为0.5 mg/mL时可清除74.44%的·OH，但明显弱于同等浓度水平VC对·OH的清除能力。
2.3.2 香荔核多糖对O2-·清除效果的测定
O2-·是生命体中最先产生的一种自由基，也是所有自由基的最初模式，反应形式多样。多糖分子中含有醛羰基，可以被氧化，也可以被还原。香荔核多糖对O2-·清除效果随浓度变化的趋向见图9。
由图9可知，香荔核多糖对O2-·具有极高的反应活性，能够清除绝大部分O2-·，且清除率随浓度增加迅速升高。当多糖浓度为0.5 mg/mL时可清除86.52%的O2-·，清除效果趋近于同等浓度水平VC对O2-·的清除能力。
图9 香荔核多糖对O2-·清除效果随浓度变化的趋向
Fig.9 The scavenging trend of polysaccharides from semen litchi on O2-·
2.3.3 香荔核多糖总还原力的测定
多糖分子中含有醛羰基，可以有效的还原氧化剂，因而具备一定的还原能力。香荔核多糖总还原力随浓度变化的趋向见图10。
图10 香荔核多糖总还原力随浓度变化的趋向
Fig.10 The trend of polysaccharides’total reducing power from semen litchi
由图10可知，随着多糖浓度增加，醛羰基含量上升，多糖总还原力随之提高。当多糖浓度＞0.3 mg/mL时，总还原力随浓度升高继续增加但增速趋缓。当多糖浓度为0.5 mg/mL时，总还原力达到0.596。在所研究的浓度范围内，香荔核多糖的总还原力均明显弱于同等浓度水平VC的总还原力。
3 结论
本课题采用超声波辅助热水浸提法提取香荔核中的多糖。在单因素试验结果的基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件对该提取方法实施响应面优化试验设计，取得了该工艺的回归模型。通过对该模型进行方差分析可知，该模型与实际提取过程具有极好的匹配度，可用于试验中分析及预测多糖提取率随因素、水平变化的波动情况。在所考察的因素水平范围中，各因素对多糖提取率的影响显著顺序：超声功率＞液料比＞提取温度，其中提取温度与超声功率的交互作用、液料比与超声功率的交互作用对多糖提取率亦有极显著影响。在模型分析的基础上结合实际操作，确定香荔核多糖最佳提取工艺参数：提取温度58℃，液料比 24 ∶1（mL/g），超声功率 620 W，超声时间 20 min，此条件经平行试验证实平均提取率10.04%与模型预测值10.72%相近，可行。多糖的抗氧化活性体外测试表明，多糖具有较强的清除自由基能力，当多糖浓度为0.5 mg/mL时，对·OH、O2-·的清除率可达74.44%、86.52%，总还原力为0.596，且其抗氧化活性与多糖浓度成正向线性关系。本课题的研究成果为荔枝核中有效物质的提取、应用及百色荔枝的综合开发提供一定的数据支持。
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