由于亚硝酸盐的发色和抑菌作用，肉类制品中允许其作为发色剂限量使用。但亚硝酸盐会对人体产生毒性，其中主要原因是它可以使血红蛋白的亚铁离子氧化成铁离子，从而引起高铁血红蛋白症，导致人体组织携氧能力受损[1]。此外，亚硝酸盐还会与肉中蛋白质分解产生的胺类物质发生亚硝化反应，生成亚硝胺类物质，具有强致癌性[2]。
生姜（Zingiber officinale Roscoe）的主要成分可大致分为两类：姜油树脂和挥发油，是中国人熟知且日常使用率极高的一种香辛料。生姜具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、止痛等多种药理作用，普遍认为生姜中的活性物质是非挥发性的辛辣味成分，即姜酚、姜烯酚、姜酮酚、姜油酮等，统称为姜辣素[3-5]。
目前姜辣素的提取方法主要有有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、酶法辅助提取法、超临界萃取法等[6-8]。酶解法不仅可以溶解和软化生姜的细胞壁，还会破坏细胞壁的主要成分，即纤维素的β-1，4-糖苷键，使得细胞结构疏松，生姜中的有效成分会更多的溶解出来。有研究表明酶解法能提高姜油树脂得率、6-姜酚以及总多酚的提取率[9]。超声辅助提取法可以使得分子移动和溶剂渗透加快，进而提高姜辣素的提取率。因此，目前已有将纤维素酶酶解法与超声辅助及微波辅助提取相结合的研究[10-11]。但是超声辅助提取可能会使提取物中的某些活性成分发生降解、聚合、氧化等多种反应[12-13]，进而影响所提取的姜辣素的活性。所以获得提取率和活性都较高的姜辣素的提取方法仍值得研究。
有研究表明生姜微波水提液经提取工艺优化后对亚硝酸盐的清除率为30.14%[14]。陈冬丽[15]等研究了在模拟胃液（pH=3.0，温度37℃）的条件下南姜水提液对亚硝酸盐的清除作用，研究发现2 mL的水取液对亚硝酸盐的清除率最大，其清除率为53.12%。而将经酶解法辅助提取的姜辣素粗提物用于清除亚硝酸盐和优化其反应条件的研究还未见报道。因此，本试验以生姜为原料，采用纤维素酶法辅助乙醇提取姜辣素类物质，研究其最佳提取工艺，并将提取的物质用于清除亚硝酸盐的研究，以期为为开发天然有效的亚硝酸盐清除剂提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生姜品种为山东大姜，产自浙江嘉兴嘉善，经60℃鼓风干燥10 h，含水量为11%，使用前将生姜粉碎过100目筛备用。
纤维素酶（10 000 U/g）、香草醛标准品（纯度为99%）：阿拉丁试剂有限公司；无水乙醇、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
PH070A恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；TGL20M高速冷冻离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；SHJ-6AB磁力搅拌水浴锅：金坛市良友仪器有限公司；UV-2550分光光度计：日本岛津公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；195（A65412906）真空冷冻干燥机：美国LABCONCO公司。
1.3 方法
1.3.1 姜辣素的提取及其提取率的测定
采用纤维素酶酶解法辅助乙醇提取姜辣素，参照唐仕荣[6]等的方法测定姜辣素的提取率。将粉碎过筛的生姜粉加入到一定量溶解在蒸馏水中的纤维素酶溶液，在一定温度下提取一段时间，在50℃的条件下经无水乙醇萃取及沉淀后经4 000 r/min离心15 min。取3.5 mL上清液用乙醇定容于10 mL比色管中，摇匀后测定其在280 nm处的吸光值，按式（1）计算生姜中姜辣素的提取率：
式中：T为姜辣素提取率，%；C为测定样品吸光值对应的香草醛浓度，μg/mL；N为提取液的稀释倍数；M为称取的生姜粉末质量，g；V为样品液的总体积，mL；2.003为香草醛换算成姜辣素的系数。
1.3.2 酶解法辅助提取姜辣素的最佳工艺条件优化
1.3.2.1 单因素试验
称取适量粉碎干燥的生姜粉末，通过改变酶解时间（30、60、90、120、150 min）、酶解温度（30、35、40、45、50℃）、纤维素酶的添加量（0.60%、0.95%、1.30%、1.65%、2.00%）以及料液比（1∶20、1 ∶35、1 ∶50、1 ∶65、1∶80 g/mL）进行单因素试验，以姜辣素提取率为指标，考察上述不同因素对姜辣素提取率的影响。
1.3.2.2 正交试验
根据单因素试验的结果，设计四因素三水平的正交试验，因素水平设计见表1，对纤维素酶酶解法提取进行优化。
表1 酶解法提取正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design of cellulase-assisted extraction
1.3.3 有机溶剂浸提法
提取方法参考张鲁明[16]等文献的报道，将一定质量的生姜粉置于80%的乙醇中，料液比为1∶10（g/mL），置于50℃的恒温水浴锅中，期间不断搅拌，提取2 h。
1.3.4 姜辣素粗提物的提取及制备
按1.3.1的方法得到姜辣素提取液。将上清液于50℃进行旋转蒸发，除去乙醇。取剩余的少量溶液置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，得到姜辣素粗提物粉末。
1.3.5 姜辣素粗提物清除亚硝酸盐的最佳反应条件优化
1.3.5.1 单因素试验
通过改变反应体系温度（20、40、60、80、100 ℃）、姜辣素粗提物添加量（1、2、3、4、5 mL）、姜辣素粗提物质量浓度（7.5、10.0、12.5、15、17.5 mg/mL）、反应时间（10、15、20、25、30 min）进行单因素试验，以亚硝酸盐清除率为指标，考察上述不同因素对亚硝酸盐清除率的影响。
1.3.5.2 正交试验
根据上述单因素试验对亚硝酸盐清除的结果，设计三因素三水平的正交试验，因素水平设计见表2，对亚硝酸盐清除的反应条件进行优化。
表2 姜辣素粗提物清除亚硝酸盐正交试验因素水平表
Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design of reaction conditions for nitrite scavenging by crude extracts of gingerols
1.3.6 亚硝酸盐清除率的测定
参考盛玮[17]等的方法并略作修改。取10 mL比色管，分别加入一定体积用无水乙醇配成一定浓度的姜辣素溶液，再加入5 μg/mL的NaNO2溶液2.0 mL，在不同温度下反应一定时间，立即加入0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL，混匀，静置5 min后，各加入1.0 mL 0.2%盐酸萘乙二胺溶液，静置15 min，加水至刻度混匀，在波长538 nm条件下测定吸光度A1，同时以蒸馏水代替NaNO2溶液作为空白对照试验测定吸光度A01，以无水乙醇代替姜辣素溶液的空白对照试验测定吸光度A02。姜辣素粗提物对亚硝酸盐的清除率按式（2）计算：
2 结果与分析
2.1 酶解法提取姜辣素的单因素试验
2.1.1 酶解时间对姜辣素提取率的影响
酶解时间对姜辣素提取率的影响见图1。
图1 酶解时间对生姜中姜辣素提取率的影响
Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction yield of gingerols from ginger
由图 1可以看出，料液比为 1∶65（g/mL）、纤维素酶添加量为2%、酶解温度为45℃，当酶解时间在30 min～60 min范围时，姜辣素提取率随着酶解时间的延长而缓慢增加，当酶解时间在60 min～90 min范围时，提取率明显增加。当酶解时间大于90 min时，提取率反而下降。可能的原因是随着时间的延长，纤维素酶的活力逐渐提高，酶解反应也充分发挥了作用，导致姜辣素不断地从生姜中释放。但酶解时间延长到一定时间后，有效成分已经基本溶出，随着酶解时间继续增加，提取率反而会下降。说明酶解时间过长不利于提高姜辣素的提取率，还会增加热能的消耗和时间的浪费[8]。因此，选择最适合的酶解时间为90 min。
2.1.2 酶解温度对姜辣素提取率的影响
酶解温度对姜辣素提取率的影响见图2。
图2 酶解温度对生姜中姜辣素提取率的影响
Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction yield of gingerols from ginger
由图2可知，当酶解温度在30℃～45℃之间，姜辣素提取率随着温度的升高而增大。当温度超过45℃时，姜辣素提取率有所下降。这是因为随着温度升高，分子运动速度不断加快，渗透扩散，溶解速度加快[18]。同时温度可引起细胞膜结构的变化，使姜辣素由生姜的细胞中扩散到溶液中。但是温度过高可引起蛋白质变性，使得纤维素酶活性降低，导致其对姜辣素的提取率降低[19]。因此，纤维素酶酶解提取生姜中姜辣素的最佳温度选择45℃。
2.1.3 纤维素酶添加量对姜辣素提取率的影响
纤维素酶添加量对姜辣素提取率的影响见图3。
图3 纤维素酶添加量对生姜中姜辣素提取率的影响
Fig.3 Effect of cellulose dosage on the extraction yield of gingerols from ginger
由图3可知，当纤维素酶用量为1.30%时，姜辣素提取率最高。纤维素酶添加量低1.30%时，随着纤维素酶添加量的增加，姜辣素提取率也随之增加。这是因为酶添加量低时，酶解反应进行得不够完全；达到最佳值时，酶解反应进行得比较完全，提取率也达到最高。当酶添加量继续增加，由于底物浓度对酶达到饱和，导致纤维素酶降解细胞壁的作用受到抑制，所以姜辣素提取率下降[18]。
2.1.4 料液比对姜辣素提取率的影响
当纤维素酶添加量为1.3%、酶解温度45℃、酶解90 min，料液比对生姜中姜辣素提取率的影响如图4所示。
图4 料液比对生姜中姜辣素提取率的影响
Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on the extraction yield of gingerols from ginger
当溶剂用量不断增大时，姜辣素提取率不断增加。当料液比达到1∶50（g/mL）时，几乎达到饱和状态，再增大溶剂用量，姜辣素提取率反而会有少量下降。过多的溶剂使用不仅可以阻碍提取，还会吸收热量，增大后续浓缩等工艺的难度[20-21]。因此，选择1∶50（g/mL）为最佳料液比。
2.2 酶解法提取姜辣素的正交试验结果
纤维素酶解提取姜辣素的正交试验结果及方差分析结果见表3与表4。
表3 姜辣素最佳提取工艺优化的正交试验设计与结果
Table 3 Orthogonal array design with experimental results for optimization of crude extracts of gingerols
表4 姜辣素提取正交试验方差分析
Table 4 Analysis of variance of the orthogonal array design for optimization of gingerols extraction
注：F0.01（2，4）=18.0，F0.05（2，4）=6.94，**为0.01水平差异极显著；*为0.05水平差异显著。
由表3可知，极差值的大小反应了各因素对姜辣素提取率的影响，料液比（D）对姜辣素提取率的影响最大，其次是酶解时间（A），纤维素酶添加量（C），最后是酶解温度（B）。由表2.3的方差分析可知，上述因素中料液比和酶解时间对姜辣素提取率的影响均达到极显著水平（P＜0.01），纤维素酶添加量和酶解温度对姜辣素提取率的影响达到显著水平（P＜0.05）。
2.3 提取方法的比较
纤维素酶解法与有机溶剂浸提法比较结果见表5。
表5 纤维素酶解法与有机溶剂浸提法比较结果
Table 5 Comparative extraction rate of gingerols by celluloseassisted extraction and conventional solvent extraction
在最佳提取工艺A2B3C1D2，即酶解时间90 min、酶解温度为50℃、添加0.95%纤维素酶、料液比为1∶50（g/mL）下对进行酶解提取，重复3次，提取率分别为1.85%、1.85%、1.84%，平均提取率为1.85%，纤维素酶法得到的提取液中的姜辣素提取率比普通乙醇溶剂浸提法均提高了28%。纤维素酶酶解法明显优于乙醇浸提法（P＜0.05）。
2.4 不同反应条件对姜辣素粗提物清除亚硝酸盐的影响
2.4.1 反应体系温度对亚硝酸盐清除率的影响
12.5 mg/mL的冻干姜辣素粗提物在添加量1 mL、反应时间15 min的条件下，反应体系的温度对亚硝酸盐的清除力的影响见图5。
图5 不同反应温度对亚硝酸盐清除率的影响
Fig.5 Effect of reaction temperature on the scavenging rate of nitrite
随着反应温度的升高，姜辣素粗提物对亚硝酸盐清除率逐渐增加，这说明反应温度的提高有助于其快速捕捉亚硝酸根离子提高清除率。当反应温度超过60℃时，亚硝酸盐清除率明显上升，当温度到达100℃时亚硝酸盐清除率最高可达25.34%。产生该现象的原因可能是姜辣素中的某些活性成分在高于60℃的条件下会发生一定的变化生成清除能力更强的物质[22]。
2.4.2 姜辣素粗提物添加量对亚硝酸盐清除率的影响
在反应体系温度为100℃、反应时间为15 min，不同添加量对冻干姜辣素粗提物对亚硝酸盐清除能力的影响见图6。
图6 不同姜辣素粗提物添加量对亚硝酸盐清除率的影响
Fig.6 Effect of different dosage of gingerols on the scavenging rate of nitrite
亚硝酸盐的清除率随着姜辣素粗提物添加量的增加而逐渐增大，说明在一定时间内可以通过增加姜辣素添加量的方式来提高其对亚硝酸盐的清除效果。当添加量为4 mL时对亚硝酸盐的清除率基本达到最高，为85.89%。当添加量超过4 mL时，亚硝酸盐清除率增加缓慢，这一研究结果与李佩艳[23]等对牡丹叶黄酮提取液添加量的结果一致。因此姜辣素粗提物的最优添加量选用4 mL。
2.4.3 姜辣素粗提物质量浓度对亚硝酸盐清除率的影响
在反应体系温度为100℃、反应时间为15 min，添加4 mL不同质量浓度的冻干姜辣素粗提物对亚硝酸盐清除能力的影响见图7。
图7 不同姜辣素粗提物质量浓度对亚硝酸盐清除率的影响
Fig.7 Effect of gingerols concentration on the scavenging rate of nitrite
姜辣素粗提物对亚硝酸盐的清除能力随着质量浓度的逐渐增加而增强。当质量浓度达到15 mg/mL之后，清除率增长开始减慢。说明在一定的反应时间内，可以通过增加姜辣素粗提物质量浓度的方式来提高其对亚硝酸的清除作用[24]。
2.4.4 反应时间对亚硝酸盐清除率的影响
在反应体系温度为100℃，添加4 mL质量浓度为15 mg/mL姜油树脂的条件下，不同反应时间对亚硝酸盐清除能力的影响见图8。
图8 不同反应时间对亚硝酸盐清除率的影响
Fig.8 Effect of reaction time on the scavenging rate of nitrite
由图8可知，姜油树脂对亚硝酸盐的清除速度较快，在反应15 min时对亚硝酸盐的清除作用已经基本完全。延长反应时间不能提高亚硝酸盐清除率，反而会使得清除率有所下降[23]。
2.5 姜辣素粗提物清除亚硝酸盐的正交试验结果
纤维素酶解提取姜辣素的正交试验结果及方差分析结果见表6及表7。
表6 姜辣素粗提物清除亚硝酸盐的正交试验设计与结果
Table 6 Orthogonal array design with experimental results for nitrite scavenging by crude extracts of gingerols
续表6 姜辣素粗提物清除亚硝酸盐的正交试验设计与结果
Continue table 6 Orthogonal array design with experimental results for nitrite scavenging by crude extracts of gingerols
表7 姜辣素粗提物清除亚硝酸盐的正交试验方差分析
Table 7 Analysis of variance for optimization of reaction conditions for nitrite scavenging
注：F0.01（2，4）=18.0，F0.05（2，4）=6.94，**为0.01水平差异极显著；*为0.05水平差异显著。
由表6可知，极差值的大小反应了各因素对姜辣素粗提物清除亚硝酸盐的影响，反应温度（A）对亚硝酸盐清除率的影响最大，其次是姜辣素粗提物的质量浓度（B），最后是反应时间（C）。由方差分析结果可知，反应温度对亚硝酸盐清除率的影响达到极显著水平（P＜0.01），姜辣素提取物质量浓度对亚硝酸盐清除率的影响达到显著水平（P＜0.05），而反应时间的影响不显著，这与表6中的极差分析结果相符。
在最佳的反应条件A3B3C2，即添加质量浓度为17.5 mg/mL的姜辣素粗提物与亚硝酸盐在100℃下反应15 min测定其对亚硝酸盐的清除率分别为99.56%、99.02%、99.38%，平均的亚硝酸盐清除率为（99.32±0.22）%。添加1 mg/mL的抗坏血酸溶液对亚硝酸盐的清除率可达（99.74±0.13）%，而达到相同效果需要的姜辣素粗提物的量则多于所需的抗坏血酸的量。
3 结论
生姜具有多种生理活性，而其中的主要活性物质为姜辣素，采用纤维素酶法辅助乙醇提取其中的姜辣素，通过单因素试验和正交试验得到最佳提取工艺：纤维素酶酶解时间为90 min、酶解温度为50℃、添加0.95%纤维素酶、料液比为 1 ∶50（g/mL），在此条件下生姜中的姜辣素的平均提取率为1.85%，高于乙醇浸提法，也高于杨毅等[25]采用纤维素酶与半纤维素酶法联合提取的提取率，仅比李小龙等[26]采用纤维素酶法结合超声提取的提取率低6.57%。但本试验的操作温度较低，可较好的保证姜辣素粗提物的原有活性。且与以往关于纤维素酶辅助提取姜辣素的研究的不同之处在于本试验固定了生姜粉的添加量不变，通过改变溶剂的用量达到改变料液比的目的，可以降低由于溶剂不足而使得姜辣素等有效物质难以溶出所导致的提取率降低的不利影响[10，25-26]。
生姜中的姜辣素粗提物具有明显的清除亚硝酸盐的作用，通过对反应条件进行优化后得到清除亚硝酸盐的最优反应条件为反应温度100℃、4 mL质量浓度为17.5 mg/mL姜辣素粗提物、反应时间15 min，在最优条件下其对亚硝酸盐的清除率可达99.32%，与1 mg/mL同体积的抗坏血酸溶液对亚硝酸盐的清除能力相当。
生姜中的姜辣素粗提物能有效地清除亚硝酸盐，可能具有一定的防癌作用。我国生姜资源丰富，采用纤维素酶酶解法从生姜中提取姜辣素类物质并将其用于亚硝酸清除的研究，具有操作简便、安全性高的特点。因此具有广阔的应用前景，值得研究人员们更加深入地研究。
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