赵申升，相飞，汪立平*，张笑笑，张杰
（上海海洋大学食品科学与技术学院，上海201306）
摘要：在一定范围内添加辣蓼对酵母的生长有促进作用。对辣蓼甜酒曲制作过程中辣蓼添加量、种曲添加量和培曲时间等进行单因素分析，以糖化力和发酵力为指标，正交试验结果表明辣蓼甜酒曲的最佳制曲工艺条件为：辣蓼添加量6%，种曲添加量4%，培曲时间72 h，并通过酿酒试验验证辣蓼甜酒曲所制甜米酒酸甜爽口，酒度适宜。
关键词：辣蓼；酵母菌；甜酒曲；正交试验
辣蓼（Polygonum hydropiper Linn.）在我国是一种分布广泛且资源丰富的一年生草本植[1]。辣蓼是一种传统中草药，具有抑菌[2]、杀虫[3-4]、抗氧化[5]、抗肿瘤等多种生物活性，在医药、植物源农药及食品领域有良好的开发前景[6]。在传统甜酒曲的制作过程中，往往会加入一定量的中草药，如辣蓼、陈皮、甘草等，其中以辣蓼在甜酒曲制作中的应用最为广泛[7-8]，既能保持传统米酒的独特风味，防止酸败和产生异味，又可以促进霉菌和酵母的生长[9-10]，提高甜酒曲的质量。
在辣蓼的研究中，缪珊等[11]试验结果表明辣蓼提取液对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌有不同程度的抑制作用。Gusakova等[12]试验也表明，辣蓼的水提物对部分革兰氏阴性菌有相当的抗菌活性。辣蓼对有害菌的抑制效果是传统甜酒曲品质的重要保障之一。辣蓼在抑制有害细菌的同时，还能促进在甜米酒发酵过程中起关键作用的霉菌和酵母的生长[13]。高永强等[14]的研究表明，在一定范围内添加辣蓼对酵母质量具有良好的促进作用，可以提高酵母的发酵力，但辣蓼对霉菌和酵母的生长的具体影响尚未有详细报道。本文研究了不同辣蓼添加量下酵母和霉菌的生长情况，辣蓼对酵母的生长曲线的影响作用。同时以糖化力和发酵力为指标，正交试验优化辣蓼甜酒曲的制曲工艺，寻求最佳的制曲条件。本研究旨在发掘传统中草药辣蓼在甜酒曲中的应用，既能保持传统甜米酒的风味和口感，又可以改善制曲工艺[15]，促进甜酒曲生产的标准化和工业化。
1.1 材料与试剂
辣蓼：产自广东梅州；甜酒曲种、米曲霉、酿酒酵母：上海海洋大学食品学院生物技术实验室保藏；大米：上海临港新城农工商超市；二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
PDA培养基：称200g土豆加水煮烂，用八层纱布过滤，取滤液，加20g葡萄糖，琼脂15g，补水到1000mL。PDA液体培养基中不加琼脂，同样方法配制。上述培养基，121℃、0.1MPa，灭菌20min。
1.2 仪器与设备
LDZX-30FA型灭菌锅：上海申安医疗器械厂；UV-2000分光光度计：美国UNICO公司；隔水式恒温培养箱：上海一恒科学仪器公司；DHG-Ⅲ电热恒温干燥箱：上海新苗医疗器械公司。
1.3 方法
1.3.1 辣蓼对霉菌和酵母生长的影响
以米曲霉[16]和酿酒酵母为研究对象，通过将一定量的米曲霉孢子液和酿酒酵母种子液接种到分别含有0%、5%、10%、15%和20%辣蓼提取液的PDA培养基中，在30℃的条件下，米曲霉培养48 h，酿酒酵母培养24 h，之后进行菌落计数，确定辣蓼是否对霉菌和酵母有增殖作用。辣蓼提取液按照文献[17]所示的方法制备。
1.3.2 辣蓼甜酒曲的制作工艺
1.3.3 辣蓼甜酒曲的单因素试验
在预试验的基础上，设定发酵温度为30℃，分别以辣蓼添加量0%、6%、9%、12%和15%，种曲添加量为2%、4%、6%、8%和10%，培曲时间为24、36、48、60 h和72 h的条件下进行单因素试验。以甜酒曲的糖化力和发酵力为评价指标进行评价。
糖化力测定方法：在40℃pH4.6条件下，每小时水解凝胶化淀粉产生1mg葡萄糖作为一个酶活力单位。测定方法：以3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定糖化酶水解淀粉产生葡萄糖的量表示酶活性，具体操作如参考文献所示[18-19]。
发酵力的测定采用CO2失重法[20]，发酵力（以CO2重量计
式中：W1为发酵前发酵瓶加内容物重，g；W2为发酵后发酵瓶加内容物重，g；Ws为样量，g。
1.3.4 正交试验优化辣蓼甜酒曲的制曲工艺
以单因素试验的数据作为依据，选择辣蓼添加量、种曲添加量和培曲时间三因素两水平设计L4（23）正交试验，优化辣蓼甜酒曲的制曲工艺。由于对甜酒曲的品质评价并没有统一标准，因此在试验中选择影响甜酒曲质量的2个关键性指标，甜酒曲的糖化力和发酵力作为甜酒曲品质评价依据，最终确定辣蓼甜酒曲的制曲工艺。
1.3.5 酿酒试验验证辣蓼甜酒曲
酿酒试验测定的主要指标有甜米酒的pH值、含糖量、总酸含量、酒精度和固形物含量。pH值测定使用pH计，含糖量测定参照推荐性国家标准GB/T 5009.7-2008《食品中还原糖的测定》，总酸含量测定参照推荐性国家标准GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》，酒精度使用附温比重瓶法，方法参照推荐性国家标准GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，固形物含量测定使用沥干称重法，参照推荐性国家标准GB/T 10786-2006《罐头食品的检验方法》进行。感官评定标准参照上海地方标准DB31/433-2009《酒酿卫生要求》（十分制），具体评价指标见表1。
表1 感官评分表
Table1 The factors of sensory evaluation
2.1 辣蓼草对霉菌和酵母的增殖作用
将log数为2.2的酵母菌种子液和log数为2.1米曲霉孢子液接种到含有不同量辣蓼的培养基中培养。在30℃的条件下，酵母培养24 h，米曲霉培养48 h，进行菌落计数，结果如表2所示。
表2 不同辣蓼添加量对酵母和米曲霉生长的影响
Table2 Effect of different additive amount of Polygonum hydropiper on grow th of yeast and Aspergillus oryzae
和对照组相比，在加入辣蓼提取液的条件下，酵母和米曲霉菌的数量都有一定程增加。当辣蓼添加量为10%时，酵母数量增加6.6倍，米曲霉数量增加1.3倍，辣蓼对酵母菌数量提升较为明显。根据上述测定结果和相关参考文献，对酿酒酵母在10%的辣蓼培养液中的生长曲线进行测定，结果如图1所示。
图1 10%辣蓼对酵母生长曲线的影响
Fig.1 Effect of 10% Polygonum hydropiper on growth curve of yeast
从图1中可以看出，酿酒酵母在10%的辣蓼培养液中繁殖速度较快，生长旺盛且较早进入稳定期。
2.2 甜酒曲制曲工艺的单因素试验结果
2.2.1 辣蓼添加量对甜酒曲糖化力和发酵力的影响
辣蓼对甜酒曲品质的影响是本试验中重点关注的因素之一，通过在甜酒曲的制作过程中加入不同量的辣蓼来确定对甜酒曲品质的影响，结果如图2所示。
图2 辣蓼添加量对甜酒曲的影响
Fig.2 Effect of Polygonum hydropiper on rice wine starter
经过比对相关文献和前期试验，确定辣蓼在酒曲中的添加量为6%、9%、12%、15%，和不添加辣蓼甜酒曲的对照组相比，在甜酒曲中添加辣蓼对糖化力和发酵力都有显著提升。随着辣蓼添加量增加，甜酒曲的糖化力和发酵力有所下降，这可能是因为过高的辣蓼含量会对微生物的代谢产生一定干扰，但和对照组相比仍然有所提升。当辣蓼的添加量为6%时，甜酒曲的糖化力和发酵力的值均为最高。由于辣蓼添加量为6%和9%时，甜酒曲的糖化力和发酵力较高，因此选择这两组进一步正交试验。
2.2.2 种曲添加量对甜酒曲糖化力和发酵力的影响
不同种曲添加量对甜酒曲的糖化力和发酵力影响如图3所示。
图3 种曲添加量对甜酒曲的影响
Fig.3 Effect of koji on rice wine starter
随着种曲添加量的增加，甜酒曲的糖化力呈现先增大后减小的趋势，在添加量为4%的时候，糖化力的值最高。而发酵力则随着种曲添加量的增大而增加，这是因为随着种曲添加量的增大，酵母的数量必然有所增加，从而影响发酵力值。考虑到甜米酒甜酸爽口、酒精度适宜的特点，选择种曲添加量为2%和4%进行正交试验。
2.2.3 培曲时间对甜酒曲糖化力和发酵力的影响
培曲时间反应甜酒曲中主要霉菌和酵母的生长以及代谢产物的积累情况[21]，培曲时间对甜酒曲的糖化力和发酵力影响如图4所示。
图4 培曲时间对甜酒曲的影响
Fig.4 Effect of the incubation time on rice wine starter
培曲时间达到48 h后，甜酒曲糖化力达到较高的水平状态，随着培曲时间延长，糖化力有所波动。而发酵力的波动较小，在36 h时发酵力值达到最高，之后又缓慢下降。在正交试验中选择培曲时间48 h和72 h的条件进行。
2.3 正交试验结果
辣蓼甜酒曲制作工艺的正交试验结果如表3所示。
表3 L4（23）正交试验方案及结果
Table3 The program and results of orthogonal experiment L4（23）
续表3 L4（23）正交试验方案及结果
Continue table3 The program and results of orthogonal experiment L4（23）
由表观察可知，辣蓼甜酒曲的最佳制作工艺条件方案为试验2，A1B2C2。通过极差分析和方差分析，不同因子影响指标的主次顺序为B>A>C。在正交试验设计范围内分析得出最佳制曲条件是：A1B2C2，即辣蓼草添加量为6%，种曲添加量为4%，培曲时间为72 h。
2.4 酿酒试验评价辣蓼甜酒曲的品质
通过正交试验得到的辣蓼甜酒曲的制曲工艺，并进行发酵试验验证此辣蓼甜酒曲制作甜米酒品质和口感，依上海地方标准DB31/433-2009《酒酿卫生要求》对甜米酒的主要指标进行评价，具体评价结果如表4所示。
表4 辣蓼甜酒曲与非辣蓼甜酒曲之间不同指标的对比
Table4 Comparison of different standards between rice wine starter and Polygonum hydropiper rice wine starter
注：-表示该指标中未给出相关要求。
用辣蓼甜酒曲所制甜米酒的主要指标均满足上海地方标准DB31/433-2009《酒酿卫生要求》的要求，同时和不含辣蓼甜酒曲所制作的甜米酒相比，其感官评价值更高，酸甜爽口，酒度适宜，具有甜米酒独特的风味和口感。
在一定范围内添加辣蓼对霉菌和酵母的生长均有促进作用，辣蓼会对酵母的生长曲线有重要影响，可以缩短对数期，延长稳定期。但对辣蓼促进其生长的作用机理，还有待于作进一步研究。通过单因素和正交试验确定辣蓼甜酒曲的最佳生产工艺参数为：辣蓼添加量6%，种曲添加量4%，培曲时间72 h。以辣蓼甜酒曲进行酿酒试验，所制甜米酒，味甜爽口，酒香浓郁，保留了传统甜米酒独特的口感和滋味。
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Effect of Polygonum hydropiper on Yeast and Its Application in the Production of Rice Wine Starter
ZHAO Shen-sheng，XIANG Fei，WANG Li-ping*，ZHANG Xiao-xiao，ZHANG Jie
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）
Abstract：A certain quantity of Polygonum hydropiper can promote the growth of yeast in sweet rice wine starter.To analysis the single factors during the making process of rice wine starter，and to choose the saccharifying power and fermenting power as the evaluation index，the final results of orthogonal test showed that the optimum making process of sweet rice wine starter as follows：Polygonum hydropiper 6%，koji 4%，the incubation time 72 h.And liquor-making experiments showed that the sweet rice wine made by the rice wine starter was a kind of good alcoholic beverages，which had sweet taste and fresh flavor.
Key words：Polygonum hydropiper；yeast；rice wine starter；orthogonal experiment
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.02.025
收稿日期：2016-03-15
基金项目：上海海洋大学大学生科研创新项目（xj2013041）
作者简介：赵申升（1992—），女（汉），本科，研究方向：食品生物技术。
*通信作者：汪立平（1968—），女（汉），副教授，研究方向：食品微生物与发酵工程。