环介导等温扩增技术在典型食源性致病菌检测中的应用进展

梁玉林，刘秀*，丁梦璇，刘远远，尹建军

（中国食品发酵工业研究院，北京100015）

摘 要：环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是一种新颖的核酸恒温扩增方法。因其具有简单、快速、特异性强的特点，在国外已经成功应用于多个行业，并在其中发挥着越来越重要的作用。阐述LAMP技术在大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌4种食源性致病菌检测中的最新研究进展，将近年来针对4种细菌建立的LAMP方法中的靶基因、灵敏度和特异性进行汇总比较，对LAMP试验常见问题进行分析，展望其在中国食源性致病菌检测领域的研究和应用发展前景。

关键词：环介导；大肠杆菌；沙门氏菌；志贺氏菌；金黄色葡萄球菌；靶基因

近年来，我国食品安全事件多发，由微生物污染而引起的食源性疾病危害远超违法滥用添加剂、农药残留等食品化学性污染。虽然我国建立了国家食源性致病菌监测网络，为食品安全和风险评估提供了科学依据，但是食源性致病菌检测手段还比较滞后。目前我国对食源性致病菌检测方法主要依靠传统分离、培养及生化鉴定[1]。该方法耗时长，操作繁琐，容易受环境和主观因素影响，不能满足现代食品生产和流通的需要，因此开发快速便捷的检测方法迫在眉睫。随着生化、计算机等领域的发展，以ELISA为代表的免疫学检测方法虽然具有快速便捷等优点，但其对试剂的选择性高，抗体昂贵且不易保存。分子生物学技术，特别是以PCR为代表的变温核酸扩增技术在食源性致病菌检测方面发挥着重大作用。尽管该方法操作简单，但需要借助高精密的仪器设备，不易在基层推广。

日本学者Notomi等[2]在2000年发明的一种全新的核酸体外扩增新技术—环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。其基本原理是利用四条特异性引物分别识别靶基因的六个特定区域，同时采用具有链置换活性的DNA聚合酶，在60℃～65℃恒温条件下进行的快速扩增反应。LAMP技术具有灵敏度高、特异性强、速度快、设备简单等优点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于实时荧光定量PCR。近年来基于LAMP技术开发的快速检测食源性致病菌方法层出不穷，检测的灵敏度和特异性不断提高。

1 LAMP技术在食源性致病菌检测领域的应用

1.1 LAMP技术在大肠杆菌O157检测中的应用

大肠杆菌是属于革兰氏阴性菌，大多数没有致病性。大肠杆菌广泛存在水和土壤中，如果人体免疫机能降低或者大肠杆菌入侵肠道外组织时，它们会成为条件致病菌从而引起人类疾病，轻者如腹泻，重者如肠道外出血。大肠杆菌O157感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，自1982年美国首次发现该病以来，在世界上许多国家相继爆发和流行，已成为全球性的公共卫生问题之一。表1为近年来基于LAMP技术对大肠杆菌O157检测灵敏度和特异性的研究汇总。

表1 LAMP技术在EcoliO157的检测中的应用
Table 1 The application of LAMP technology in E.coliO157 detection

注：-表示文献中并未涉及该部分。

靶基因 检测类型 检出限（灵敏性） 特异性 参考文献细菌纯培养 食物污染实验rfbE LAMP - 410 cfu/mL 3株EcoliO157和18株非EcoliO157，结果只有3株EcoliO157有扩增产物，其余菌株无扩增产物[3]LAMP 100 copy/tube - LAMP浊度仪检测到EHEC O157:H7阳性扩增结果，ETEC、EPEC、EIEC、EAEC、宋内志贺氏菌、福氏志贺氏菌未出现扩增曲线[4]LAMP 1 cfu/mL 1 cfu/g 以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板的rfbE基因进行检测，均没有发生特异性扩增[5]fliC 免疫捕获LAMP 2.5 cfu/mL 8 cfu/g 对3株EcoliO157:H7和14株非EcoliO157进行检测，只对3株EcoliO157:H7显示为阳性[6]rfbE stex LAMP rfbE、stex1和stex2分别为100、100和 10 fgDNA/tube-以rfbE基因为靶序列设计的LAMP引物在4株EcoliO157:H7均有扩增产物,有些EcoliO157:H7缺失stx1或stex2基因，这样可能扩增不出条带进而造成假阴性的问题[7]stex LAMP 1 cfu/mL 10 cfu/mL EcoliO157:H7、O139和O26基因组能够扩增出stex2相应大小条带，相应的反应管变绿色，其他为阴性[8]wzy LAMP 1 cfu/tube～20 cfu/tube 103cfu/g～104cfu/g 在120株细菌检测中没有出现假阳性和假阴性问题 [9]stex,eae LAMP 1 cfu/tube～20 cfu/tube 103cfu/g～104cfu/g 在90株细菌检测中没有出现假阳性和假阴性问题 [10]Z3276 LAMP 5 cfu/tube 103cfu/mL 对117株细菌检测，只有EcoliO157:H7出现扩增产物 [11]

大肠杆菌的rfbE和fliC基因作为靶基因具有很好的保守性[3-7]，rfbE基因是O抗原的编码基因[4]。张雪寒等[5]建立快速检测E.coli O157的LAMP方法，以rfbE基因序列设计了两对LAMP引物，通过肉眼观察结果。该方法对菌液和人工污染样品的最低检出限分别为1 cfu/mL和1 cfu/g，除大肠杆菌O157外均没有发生特异性扩增反应。

表1中除了常用的rfbE和fliC靶基因外，还有stex、eae和wzy等基因，其中stex是编码志贺毒素毒力因子基因[7-8，10]，有些大肠杆菌O157缺失stx基因，以stex基因序列设计特异性引物可能不会扩增出目的基因条带进而造成假阴性的问题。wzy是编码O抗原聚合酶的基因[9]，eae是编码紧密粘附素的基因[10]，然而wzy和eae基因除了存在于大肠杆菌O157外，也少量存在于一些肠道细菌中，从而引起其他肠道细菌基因片段的扩增，造成假阳性干扰。

1.2 LAMP技术在沙门氏菌检测中的应用

沙门氏菌是公认的食源性疾病最常见的革兰氏阴性致病菌。沙门氏菌血清型复杂，其按抗原成分，可以分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组，其中与人体疾病相关的主要是丁组的伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌。人们食用了污染了沙门氏菌的食品（猪肉、牛肉等）后会导致肠道疾病，如呕吐、发烧和腹泻等症状。表2为近年来基于LAMP技术对沙门氏菌检测灵敏度和特异性的研究汇总。

invA基因编码的蛋白在沙门氏菌致病过程中起着重要的作用，是沙门氏菌的主要毒力因子，已发表的文献大多是以沙门氏菌侵袭蛋白invA基因作为检测的靶基因[12-16]。沙门氏菌有很多不同种类，O抗原决定沙门氏菌的血清组，H抗原决定血清型，沙门氏菌因此被分为50多个血清组，超过2 500个血清型。其中伤寒和肠炎沙门氏菌同属于沙门氏菌D血清组。RAVAN等[19]以prt基因为沙门氏菌D血清组的靶基因，对5株沙门氏菌D血清组和4株其他血清组沙门氏菌进行特异性检出。由于伤寒和肠炎沙门氏菌是导致人类疾病的主要罪魁祸首，建立快速区分伤寒和肠炎沙门氏菌的检测方法对治疗食物中毒很有必要，樊粉霞等[22]以伤寒沙门氏菌的STY3671基因为靶基因，袁发浒等[23]以肠炎沙门氏菌的lygD基因作为靶基因，所建立的沙门氏菌LAMP技术检测体系达到了对伤寒和肠炎沙门氏菌很好的区分效果。

表2 LAMP技术在沙门氏菌的检测中的应用
Table 2 The application of LAMP technology in Salmonella detection

注：-表示文献中并未涉及该部分。

靶基因 检测类型 检出限（灵敏性） 特异性 参考文献细菌纯培养 食物污染实验invA LAMP 2.2 cfu/tube 2.8 cfu/tube 对39种血清型的220株肠道沙门氏菌和7株亚利桑那沙门氏菌LAMP检测结果呈阳性，其余均为阴性[12]LAMP 100 fgDNA/tube - 只对沙门氏菌有特异性扩增产物，其余均为阴性。 [13]PMA-LAMP 3.4 cfu/g～34 cfu/g 6.1×103cfu/g～6.1×104cfu/g 对53株细菌进行LAMP检测，结果没有出现假阳性和假阴性[14]RT-LAMP 101cfu/mL - - [15]LAMP 2.28 cfu/mL - 该实验所选择的引物只能扩增出沙门氏菌的目的条带,而对其余细菌均不能扩增出目的条带[16]fimY LAMP 13 cfu/tube - 通过实时浊度计成功检测出81株沙门氏菌和20株非沙门[17]Sdf I LAMP 4 copies/μL - 只有从肠炎沙门氏菌提取的DNA呈阳性，特异与FQ-PCR相当[18]Prt LAMP-ELISA 4 cfu/tube 103cfu/mL 对5株沙门氏菌D血清组和4株其他血清组沙门氏菌检测，5株沙门氏菌D血清组吸光度值高于0.282，4株其他血清组沙门氏菌呈阴性[19]phoP LAMP 10 cfu/mL 35 cfu/250 mL 成功鉴定66株沙门氏菌和73株非沙门氏菌 [20]HisJ LAMP 16 cfu/tube - 对102株细菌进行检测，通过白色沉淀和染料染色变化检测出79株沙门氏菌[21]STY RT-LAMP - 7 cfu/mL 134株伤寒沙门氏菌为阳性其余47株菌为阴性 [22]lygD LAMP 23.3 cfu/mL 26.7 cfu/mL 仅肠炎沙门氏菌出现特征性阶梯状条带 [23]

1.3 LAMP技术在志贺氏菌检测中的应用

志贺氏菌属是一类具有较强传染性、危害严重的革兰氏阴性肠道致病菌。能引起食物中毒的食品大多为肉类、乳制品等蛋白质含量比较多的食品。Igor G等[37]研究表明10 cfu～100 cfu的志贺氏菌就可通过感染肠道而致病，引发严重的炎症反应，在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。表3为近年来基于LAMP技术对志贺氏菌检测灵敏度和特异性的研究汇总。

表3 LAMP技术在志贺氏菌的检测中的应用
Table 3 The application of LAMP technology in Shigella detection

注：-表示文献中并未涉及该部分。

靶基因 检测类型 检出限（灵敏性） 特异性 参考文献细菌纯培养 食物污染实验LAMP 8 cfu/tube - 志贺氏菌和EIEC呈阳性，其他菌株为阴性 [24]LAMP 53 cfu/mL 68 cfu/mL LAMP法和PCR法均能特异性地扩增出志贺氏菌靶DNA，而其他非志贺氏菌均未扩增出[25]ipaH 交叉引物LAMP 103cfu/mL - 检测38株实验菌株，其中6株志贺氏菌检测全部为阳性 [26]LAMP 120 cfu/mL - 4株志贺氏菌、1株EIEC均为阳性，其他细菌为阴性 [27]LAMP 9.6 cfu/tube - - [28]LAMP-ELISA - 4 cfu/mL - [29]

前人发现以志贺氏菌侵袭性质抗原H（ipaH）基因作为检测的目的基因具有较好的灵敏度。该基因存在于菌体的质粒或者染色体上，是志贺氏菌检测中常用到的目的基因[24-29]。ipaH基因在特异性检测志贺氏菌方面也有一些不足，以该基因序列设计的引物不但能检测出志贺氏菌，还可以检测出肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）。SONG等[24]和张如胜等[27]以ipaH基因为靶基因对志贺氏菌、EIEC等细菌进行检测，结果表明志贺氏菌和EIEC检测结果均呈阳性，这样可能会误将EIEC当作志贺氏菌而检出。

1.4 LAMP技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用

金黄色葡萄球菌是人类的一种重要革兰氏阳性致病菌，有“嗜肉菌”的别称。广泛分布于自然界中，能引起奶牛乳房炎。人们通过食用受金黄色葡萄球菌污染的食物而引起疾病，容易受金黄色葡萄球菌污染的食物有奶、肉、蛋、鱼和其制品等。除通过食物传播外，人的化脓部位也容易感染金黄色葡萄球菌。表4为基于LAMP技术对金黄色葡萄球菌检测灵敏度和特异性的研究汇总。

目前已经查明的细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌产生的肠毒素引起的中毒案例所占比例较大。临床分离的金黄色葡萄球菌有三分之一的菌株能产生肠毒素，且肠毒素稳定不易受高温和胃液蛋白酶的破坏。肠毒素有SEA-SEO等几个血清型，GOTO等[30]在2007年以肠毒素基因SEA、SEB、SEC和SED序列为扩增靶序列。最终在44株金黄色葡萄球菌中检出30株产肠毒素金黄色葡萄球菌，其中以SEB序列为扩增靶序列检测灵敏度最高。

表4 LAMP技术在金黄色葡萄球菌检测中的应用
Table 4 The application of LAMP technology in Staphylococcus aureus detection

注：-表示文献中并未涉及该部分。

靶基因 检测类型 检出限（灵敏性） 特异性 参考文献细菌纯培养 食物污染实验SEA，SEBSEC，SED LAMP 2.3 cells/tube（SEA） - 44株金黄色葡萄球菌中有30株被检出肠毒素，11株被检出含sea基因，13株含seb基因，8株含sec基因，7株含sed基因[30]nuc LAMP 25 cfu/mL 206 cfu/mL 只有金黄色葡萄球菌有特异性条带 [31]LAMP 100 cfu/mL - 只有金黄色葡萄球菌被检出 [32]PMA-LAMP 3.2 cfu/mL 50 cfu/mL 4株金黄色葡萄球菌均检出，26株致病菌的检测均为阴性 [33]LAMP 2.01 cfu/mL - 4株金黄色葡萄球菌泳道均有LAMP扩增条带，其他26株细菌未出现条带[34]femA LAMP 8 cfu/mL～9 cfu/mL - 金黄色葡萄球菌有条带出现，其他菌株未出现 [35]Spa arcC LAMP 2.5 ng/μL（spa）102cfu/mL（arcC）对124株细菌进行检测，只对MRSA和MSSA细菌共99株检测结果呈阳性[36]

金黄色葡萄球菌可以产生一种与凝固酶相关的细胞外耐热核酸酶[31-34]，近来以编码耐热核酸酶的基因为靶基因设计LAMP引物成为热点，赵玥明等[34]以编码耐热核酸酶的nuc基因序列设计特异性引物，结果表明纯菌的检测灵敏度达到2.01 cfu/mL，是普通PCR灵敏度的100倍。

2 LAMP实验常见问题分析

LAMP技术虽然发展至今已有十余年，但是在现实推广过程中屡次遇到瓶颈，主要由于该种核酸检测方法假阳性率高。造成假阳性的原因可分为LAMP实验污染问题和引物非特异性扩增问题。

2.1 LAMP污染问题

LAMP反应具有较高的灵敏度，易受到反应试剂、反应器材及环境中污染的微量的DNA模板而导致假阳性的出现。最初LAMP扩增产物的检测方法为琼脂糖凝胶电泳，电泳出现梯状条带即可判断扩增反应发生。因LAMP反应产物较PCR大，开盖检测容易造成气溶胶污染。因此整个实验过程应该严格分区，试管等工具专用，尽量避免开盖。

在闭管检测方面，前人做了大量工作。在2001年MORI等[37]提出LAMP扩增反应产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，该衍生物与生成的扩增产物成正比。通过观察白色浑浊的有无，可验证是否有靶基因的存在。由于肉眼观测白色浑浊具有人为主观性，为了降低误判，有人从指示剂和染色剂方面进行研究。2008年TOMIA等在反应中加入钙黄绿素对扩增产物进行检测[38]。钙黄绿素与试剂中的镁离子处于淬灭状态，扩增反应的副产物焦磷酸离子与镁离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。2013年吕恒等[4]在反应体系中加入染料羟基萘酚蓝（HNB）作为LAMP扩增的指示剂。羟基萘酚蓝是镁离子的滴定剂，随着镁离子与反应析出的焦磷酸根离子形成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去镁离子而呈现天蓝色，未发生扩增反应的体系中羟基萘酚蓝则为紫罗兰色。

2.2 引物非特异性扩增问题

2007年，ZYRINA N V等[39]发现LAMP反应Bst聚合酶将寡核苷酸随机掺入有缺口的DNA模板进行跨片段扩增。为消除非特异性扩增问题，通常做法是降低体系中的环引物浓度，设计合理的引物，添加特异性探针或对环引物标记。

反应体系中只含有内外引物一般不容易出现非特异性扩增。NAGAMINE在2002年提出在LAMP内外引物基础上使用额外的一对引物，称之为环引物（LF和LB），增加环引物后能够减少LAMP的反应时间，有助于提高反应灵敏度[16]。环引物的添加除了能带来反应效率的提高，同时也可能产生非特异扩增，造成假阳性的问题。通过降低反应体系中环引物的浓度能减少非特异性扩增的发生。设计合理的引物是LAMP反应最重要的一步，在经过软件设计出引物后，需要对引物进行比对和筛选，尽量减少引物间的非特异性配对。对扩增产物能够进行特异性和非特异性区分在一定程度上也能解决非特异性扩增问题。一般是设计特异性探针，通过荧光信号检测是否为特异性扩增产物[40]。该方法需要向体系中另外添加酶，可能会对体系中的原有成分产生影响。有人提出对体系中原有的环引物LF和LB进行标记可以避免由于其他成分的添加而造成的影响，只需要确定LF和LB不会发生非特异性配对并且扩增产物能够同时检测到LF和LB。

3 总结和展望

通过对近年来大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌建立的LAMP方法进行综合分析，我们可以得出靶基因选取和引物设计对实验的成败起着至关重要的作用，在设计实验时应该充分考虑靶基因的保守性和代表性。靶基因不具有特异性，导致致病菌不能被特异性检出，进而出现假阴性和假阳性的问题。对选好的靶基因进行引物设计，在提高引物扩增反应效率的同时，也应该避免引物对之间的非特异性扩增。建立的LAMP方法对4种食源性致病菌检出限一般能达到每毫升几个菌落单位甚至更低，比PCR检出限低两个数量级。

随着LAMP技术的应用不断深入，我们对LAMP检测方法又提出新的要求。目前已知的大多数LAMP实验只能在一个体系中检测一种致病菌，在需要快速筛查多个致病菌时，需要对其进行分别检测，这会耗费较大的人力物力。为了充分利用LAMP技术优势、提高诊断检测的效率与可靠性、扩展其应用范围，同时节约试剂成本，多重LAMP技术将会是未来的发展方向。姜侃等[41]对沙门氏菌、单增李斯特和金黄色葡萄球菌建立三重LAMP方法。实验采取多重LAMP体系对3种致病菌单独检测，3种致病菌的检测灵敏度均约为10 cfg/μL，取得了满意的检测效果。食品检测中，死菌DNA长期存在使基因水平的检测方法高估了样品中活菌的水平，也有可能造成假阳性问题。RT-LAMP在以核糖核酸为基础的扩增检测中具有独特的优势，因为体系中所用的模板为提取的致病菌RNA，扩增结果呈阳性表明所检测的致病菌是处于活的增殖状态，应用于现场检测时，更能体现样本中的活菌状态，反映样本潜在的感染性。CHAYAPA等[15]对肠炎沙门氏菌建立RT-LAMP检测方法，经16 h富集培养后，纯菌加DNA酶处理与不加DNA酶处理的检出限分别为100cfu/mL和101cfu/mL。荧光染料叠氮溴化丙锭（PMA）与快速检测技术LAMP相结合也能区分死菌和活菌。PMA是对DNA具有高度亲和力的DNA荧光染料，不能透过完整的细胞膜，只能选择性地通过不完整的死细胞，PMA与死菌DNA结合使之不能发生扩增。CHEN等[14]建立了PMA-LAMP方法，通过该方法可有效的在农产品中快速检测有繁殖能力沙门氏菌。

LAMP技术是在本世纪发展起来的一种恒温核酸扩增技术，虽然还存在许多有待解决的问题，但它在不断地完善和改进。随着我国快检技术的不断发展，有理由相信LAMP技术将会有更广阔的应用前景。

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Application of Loop-mediated Isothermal Amplification in the Detection of Typical Foodborne Pathogens

LIANG Yu-lin，LIU Xiu*，DING Meng-xuan，LIU Yuan-yuan，YIN Jian-jun
（China National Research Institute of Food&Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：Loop-mediated isothermal amplification （LAMP）is a novel nucleic acid amplification method.For its simplicity，rapidity and specificity，it has been successfully applied in many industries abroad and plays an increasingly significant role.In this paper，the latest research progress of LAMP technology in the detection of four foodborne pathogens of E.coli O157，Salmonella，Shigella and Staphylococcus aureus was described.The target gene，sensitivity and specificity of the pathogenic bacteria were summarized and compared in the established LAMP method for four bacteria in recent years.The shortcomings of this technique in detection of pathogenic bacteria and the prospects of its application in China were put forward.

Key words：Loop-mediated；Escherichia coli；Salmonella；Shigella，；Staphylococcus aureus；target gene

收稿日期：2016-12-26

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.044

作者简介：梁玉林（1991—），男（汉），硕士研究生，发酵工程专业。

*通信作者：刘秀（1979—），男（汉），高级工程师，主要从事食品真实性检测。