表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution program
方晓丽
（平阳县疾病预防控制中心，浙江平阳325400）
摘 要：建立超高效液相色谱同时测定饮料中6种人工合成色素（柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝）的方法。饮料用聚酰胺粉吸附色素，除去杂质后用乙醇-氨水-水（7∶2∶1，体积比）洗脱色素，以甲醇-0.02 mol/L乙酸铵为流动相，梯度洗脱，在ACQUITY UPLCRBEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱上分离，在254 nm波长处检测。6种色素分离效果良好，线性范围宽，相关系数r≥0.999 5，实际样品加标回收率为82.2%～104.5%，相对标准偏差为0.04%～4.6%。
关键词：超高效液相色谱；合成色素；饮料
饮料是日常生活中的常见饮品，市场上色彩斑斓的饮料数量众多，但这些外观绚丽的饮料大部分人为添加了各种色素，其中尤以人工合成色素为多。人工合成色素大多为含有苯环或氧杂蒽结构的有机化合物，结构上分为：偶氮色素，如柠檬黄、诱惑红等；三苯甲烷系色素，如亮蓝等；氧杂蒽色素，如赤藓红等。研究表明，人工合成色素过量食用对人体有害，甚至对儿童智力产生不利影响，部分偶氮类的合成色素已被证明有致癌作用，GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[1]也明确规定了饮料中各种人工合成色素允许的最大允许添加量，但由于与天然色素相比，人工合成色素因价格便宜、色泽鲜艳、色调多样、性质稳定而被生产厂家更广泛使用并时有过量添加的现象曝光，所以建立人工合成色素的快速有效检测方法对市场饮料安全及消费者权益维护均有重要意义。
大多数文献报道采用液相色谱法[2-4]检测人工合成色素。国标GB/T 5009.35-2003《食品中合成色素的测定》[5]第一法是高效液相色谱法，但没有给出同时检测含诱惑红在内的多种合成色素的方法。最新公布的标准GB/T 5009.141-2003《食品中诱惑红的测定》[6]规定诱惑红的检测方法为纸色谱法，此方法操作麻烦，检出限高（取样量10 g，检出限为25 mg/kg），已经超出了某些食品的最大允许添加量（如肉灌肠类为15 mg/kg），无法满足日常检测工作的需要。普通液相色谱法在多目标物检测时，往往存在分离困难、分析时间长、试剂消耗量大等问题，且国标采用同一波长（254 nm）检测不同色素，特异性不强，容易出现假阳性结果。本文建立的超高效液相色谱法采用二极管阵列检测器，可扫描分离物全波段的紫外吸收光谱，显著降低假阳性结果出现的概率，且与普通液相色谱相比，超高效液相色谱采用了小颗粒杂化填料（1.7 μm），极大地提高了分离度，从而有效提高了分析速度和灵敏度，适用于饮料中多种人工合成色素同时检测，对其他类食品中合成色素的检测也有参考价值。
ACQUITY UPLC-CLASS超高效液相色谱仪配二极管阵列检测器：美国WATERS公司；SQP万分之一天平：赛利多斯公司；5430R高速冷冻离心机：CEN TRIFU公司；Milli-Q Direce纯水处理器：德国默克密理博公司。
甲醇（色谱纯）：默克股份有限公司；乙醇（分析纯）：安徽安特食品有限公司；乙酸铵（分析纯）、冰乙酸（分析纯）、聚酰胺粉（100目～200目）：国药集团化学试剂公司；氨水（分析纯）：西陇化工有限公司；甲酸（分析纯）：上海化学试剂总厂；柠檬酸（分析纯）：无锡市民丰试剂厂；试验用水为超纯水；柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝标准品：百灵威试剂公司。
5种饮料样品均购于正规超市，分别为苹果醋饮料（1#）、橙味汽水（2#）、维生素饮料（3#）、葡萄味汽水（4#）、果粒橙饮料（5#）。
吸取10.0mL样品于150mL烧杯中，碳酸饮料需经15 min超声脱气，有沉淀的果汁饮料应先5 000 r/min离心5 min。加入约1g聚酰胺粉，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽虑，用pH=4的水洗4次，然后用甲醇-乙酸（9∶1，体积比）混合溶液洗4次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水（7∶2∶1，体积比）混合溶液解吸4次，每次约5 mL，收集解吸液至150 mL锥形瓶中，蒸发至近干，用纯水定容至10mL，过0.22μm滤膜，上机测定。
色谱柱：ACQUITY UPLCR BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm；流速：0.30 mL/min；进样量：5.0 μL；流动相：A 为甲醇，B 为0.02 mol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution program
为使前处理过程尽量简便，本试验尝试将样品直接过0.22 μm滤膜后即上机检测。结果表明，1#～4#样品可过0.22 μm滤膜，但检测显示目标峰附近有较多干扰，且样品中的未知成分可能有损色谱柱和整个色谱系统，因此样品需经处理后上机，处理过程参考国标GB/T 5009.35-2003《食品中合成着色剂的测定》[5]，并对试验进行了优化。
聚酰胺粉只有在酸性条件下才可完全吸附色素。经检测，试验选取的饮料样品呈弱酸性，直接加聚酰胺粉色素即可被完全吸附，若选取的饮料呈碱性，则需用柠檬酸调节pH值到6左右。
试验表明，样品在室温下和加热至60℃聚酰胺粉吸附率无显著差异，故样品无需加热。
参考相关文献[7]，本试验选用乙酸-甲醇（1 ∶9，体积比）洗脱杂质，目标物的回收率优于国标法（国标法所用的洗脱液甲醇-甲酸（6∶4，体积比）洗脱杂质，洗脱液呈蓝色，检测结果显示有部分色素被洗脱）。
收集的解吸液需除去氨水和乙醇，本试验将解吸液直接蒸发至近干即可完全除去氨水和乙醇，相较于国标先中和后蒸发的方法更为简便，且不会影响检测结果。
由于色素的特殊结构，其不仅在紫外区有吸收，在可见光区也有最大吸收。国标及大多数文献选用254 nm为6种色素的检测波长，考虑到检测灵敏度的问题，也有选择626 nm为亮蓝的检测波长。本试验在210 nm～700 nm进行光谱扫描，考察并比较了6种色素在可见光区的最大吸收波长和254 nm波长处的信号值响应比（见表2），结果显示仅亮蓝在两波长处的响应值有较大差别，为避免多波长检测时数据处理的繁琐，初选254 nm作为柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落红和诱惑红的检测波长，以626 nm为亮蓝的检测波长，但后期试验发现亮蓝在626 nm波长处的线性范围为0.10 mg/L～10.0 mg/L，检测上限浓度太低，只适合低浓度目标物的测定，考虑到国标GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[1]规定饮料类食品中亮蓝所允许的最大添加量为0.02 g/kg，而亮蓝在254 nm处的线性范围为1.00 mg/L～200 mg/L，既能满足一般样品检测灵敏度的要求，高浓度的样品无需稀释即可进行样品处理，因此选择254 nm为6种色素的检测波长。
表2 6种合成色素在254 nm和最大吸收波长处的信号值响应比
Table 2 Signal value response ratio of six kinds of synthetic pigment at 254 nm and maximum absorption wavelength
色谱柱的选择及流动相的设置极大地影响了目标物分离效果。ACQUITY UPLC○R BEH C18色谱柱适用的pH值范围为1～12，本试验上机液近中性，0.02 mol/L乙酸铵流动相pH=4，此色谱柱可满足试验要求。试验还考察了色谱柱长度对分离效果的影响，6种合成色素在不同长度（150、100、50 mm）色谱柱上均可较好分离，但选用50 mm色谱柱可大大缩短分析时间，且相同流量下短柱柱压低，可减小色谱柱损耗。试验表明，饮料样品经前处理后，检测时可适当提高流动相中有机相的含量，使目标峰较早出峰，因此甲醇初始比例设为13%，经多次优化梯度洗脱程序后，6种色素混标溶液的分离效果良好，分离时间仅为2.2 min（见图1），有效地节约了分析时间，试验将检测时间延长至5 min，是为使柱压稳定不影响下个样品的进样以及考虑到样品中可能存在较晚出现的杂质峰。
普通的紫外检测器以色谱峰保留时间作为定性的唯一依据，此定性方法在样品检测中存在风险。本试验使用的二极管阵列检测器（PDA）可获得色谱分离组分全波段的紫外吸收光谱图，为分析者提供更准确的定性信息。以4#样品为例，首先以保留时间定性，样品检出的色素有柠檬黄、苋菜红和亮蓝，再提取目标峰的紫外吸收光谱图，结果显示，样品检出物和标样紫外吸收光谱图基本一致（4#样品和标样紫外吸收光谱图分别见图2和图3），提高了检测结果的准确性。
图1 柠檬黄（20.0mg/L）、苋菜红（30.0mg/L）、胭脂红（20.0mg/L）、日落黄（20.0mg/L）、诱惑红（80.0mg/L）、亮蓝（80.0mg/L）标准溶液色谱图
Fig.1 Chromatogram of Tartrazine（20.0 mg/L），Amaranth（30.0 mg/L），Ponceau 4R（20.0 mg/L），Sunset yellow（20.0 mg/L），Allura Red（80.0 mg/L），Brilliant Blue（80.0 mg/L）standard
图2 4#样品紫外吸收光谱图
Fig.2 UV absorption spectra of 4#sample
图3 柠檬黄、苋菜红、亮蓝标样紫外吸收光谱图
Fig.3 UV absorption spectra of Tartrazine，Amaranth，Brilliant Blue standard
在试验条件下，对6种色素的标准系列混合溶液进行测定，以质量浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到相应的线性回归方程，同时以3倍信噪比考察了6种色素的检出限，具体结果见表3。
表3 6种合成色素的线性范围、回归方程、相关系数和检出限
Table 3 Linearity range，calibration curve，correlation and detection limit of six synthetic pigments
由表3可知，6种合成色素线性范围宽，线性关系良好，检出限低。
按照试验方法分别测定1#～5#饮料中的6种合成色素含量，结果显示1#～4#样品均不同程度地添加了人工合成色素，实际测出的色素种类与样品标签一致，测定值均低于国标[1]规定允许的最大添加量。做加标回收试验时加标量对回收率的影响较大，本试验参考张虹的文献报道[8]并结合试验经验，确定加标量如下：对于饮料中检出的色素，加标量分别为本底值的50%、100%和200%；未检出的色素加标量为线性范围内低、中、高3种浓度。每个添加水平平行添加3份，计算回收率，每份测定6次，计算精密度，详细试验数据见表4。实际样品的色谱图和加标色谱图分别见图4和图5。
表4 6种合成色素的加标回收率和精密度（n=6）
Table 4 Recoveries and precision of the six pigments in spiked samples（n=6）
图4 1#样品谱图
Fig.4 Chromatogram of 1#sample
图5 1#样品加标谱图
Fig.5 Chromatogram of 1#spiked sample
本试验方法采用超高效液相色谱仪配二极管阵列检测器检测饮料样品中6种人工合成色素，试验过程处理较国标法有所优化，分离效果、回收率和精密度试验结果令人满意，显著降低了假阳性结果出现的概率，大大节约了分析时间（单个样品分析时间仅需5 min），有效地减少了试剂消耗（单个样品检测流动相消耗为1.50 mL），综上，本试验方法可作为检测饮料中上述6种人工合成色素的切实可行的检测分析方法。
参考文献：
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[6]中华人民共和国卫生部,中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.141-2003食品中诱惑红的测定[S].2004
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[8] 张虹.加标回收率的测定混溶结果判断[J].石油与天然气化工,2000,29(1):50-52
Simultaneous Determination of Six Synthetic Pigments in Beverage with Ultra High Performance Liquid Chromatography
FANG Xiao-li
（Pingyang Center for Disease Control and Prevention，Pingyang 325400，Zhejiang，China）
Abstract：An ultra-high performance liquid chromatography （UPLC）method was developed for the simultaneous determination of six kinds of synthetic pigment，including Tartrazine，Amaranth，Ponceau 4R，Sunset yellow，Allura red，Brilliant blue in beverage samples.Synthetic pigments were adsorbed by polyamide，eluted by ethanol-ammonia-water（7 ∶2 ∶1，volume ratio）after the removal of impurities，separated on an ACQUITYUPLCRBEH C18column（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）in gradient elution mode using a mobile phase made up of methanol and 0.02mol/L ammonium acetate，and detected at 254 nm.The method had good effect in separating six kinds of pigment.The calibration curves had wide linearity range with correlation coefficient r≥0.999 5.The recoveries in spiked samples were in the range of 82.2%-104.5%and the relative standard deviations（RSD）were 0.04%-4.6%.
Key words：ultra high performance liquid chromatography；synthetic pigments；beverage samples
收稿日期：2016-12-23
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.034
作者简介：方晓丽（1986—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品和生活饮用水理化检测。