图1 啤酒样品1的总离子流图
Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of the beer sample 1
周漪波，朱志鑫*，梁永威，黄潆惠
（中国广州分析测试中心广东省分析测试技术公共实验室，广东广州510070）
摘 要：啤酒中游离脂肪酸的含量对啤酒的风味具有重要的影响。采用固相萃取法对市售啤酒中游离脂肪酸成分进行提取，气相色谱/质谱法进行定性分析并外标法定量。通过添加一定加标水平的脂肪酸（辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、油酸），结果表明各脂肪酸在不同的加标浓度下都能获得较高的回收率（78.1%～93.5%），标准偏差为2.2%～3.8%，试验精密度较高。比较不同比例提取溶剂对各种脂肪酸回收率的研究，结果表明采用正己烷-乙醚（体积比50∶50）作为提取溶剂时提取效率相对最高（辛酸82.1%、癸酸84.2%、月桂酸88.4%、棕榈酸89.8%、油酸93.5%），说明该方法能准确测定啤酒中的游离脂肪酸含量。
关键词：气相色谱/质谱（GC-MS）；回收率；啤酒；游离脂肪酸
啤酒是以麦芽为主要原料，添加酒花、酵母发酵酿制而成的一种含二氧化碳、低酒精度的饮料酒[1]。啤酒中存在的挥发性、低挥发性及不挥发性有机酸超过100多种，其中游离脂肪酸在多个方面影响啤酒质量[2-4]。己酸、辛酸、癸酸、月桂酸等形成辛基风味，其中辛酸和癸酸是“酵母味”的代表物质[5]，长链不饱和脂肪酸会使麦汁浑浊，其通过氧化作用形成的氢过氧化物在一定条件下降解产生醛类等老化物质，尤其是亚油酸和亚麻酸是反-2-壬烯醛的前体物质[6]。另外，游离脂肪酸还影响啤酒的泡沫稳定性及泡沫挂杯性等[7]，啤酒中的长链脂肪酸含量一般都比较低，而当啤酒储藏在极恶劣的条件时，其含量就容易增加很多，导致啤酒口味变差[8]。再者由于饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例同泡沫相关[9-10]，而啤酒泡沫是其重要的外观特性。
为了研究游离脂肪酸对啤酒品质的影响,应该建立一套行之有效的测定方法。游离脂肪酸在啤酒中的含量极少,性质又极不稳定,如何对样品进行前处理是测定的关键。水蒸汽蒸馏[11-12]原理简单但提取过程时间长、温度高、其过程易造成成分的挥发损失，溶剂液液萃取法[13-15]仪器设备简单、操作方便，但由于啤酒样品相对基质复杂，含有碳水化合物、氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质和少量脂肪酸[16]，萃取过程中容易产生乳化现象，导致萃取物损失[17]。最近几年，顶空顶相色谱法[18]、固相微萃取法[19]等也用于啤酒中脂肪酸的提取，但这两种方法仅适合中短链脂肪酸的提取，对长链脂肪酸的萃取效率相对较低。
固相萃取是近年发展起来一种样品预处理技术，可以更有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单、省时、省力，并已经在脂肪酸分析中发挥作用[20]。本文采用固相萃取法对啤酒样品进行处理，气相色谱-质谱法检测，根据质谱特征离子结合色谱保留时间确定游离脂肪酸的组成可以消除啤酒中复杂基体的干扰。结果表明该方法具有较高的准确率和回收率，结果准确可靠，适合啤酒样品中的游离脂肪酸分析。
HP 6890GC/5973MSD气相色谱/质谱联用仪：美国安捷伦公司；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；脂肪酸甲酯对照品（1 mL，37 个组分，C4～C24 200 μg/mL～400 μg/mL）：美国 Supelco公司；辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、油酸：美国Sigma公司。
Chem Elut SLE硅藻土液/液萃取柱：美国安捷伦公司；三氟化硼-甲醇溶液：上海安谱科学仪器有限公司；正己烷、乙醚（分析纯）：广州化学试剂厂。
试验用水为GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。
啤酒样品：广州某大型超市。
取脂肪酸甲酯对照品于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，得到浓度为 20 μg/mL～60 μg/mL 的标准储备溶液；取1 mL标准储备溶液于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，得到浓度为2.0 μg/mL～6.0 μg/mL的标准溶液。
分别准确称20.0 mg辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、油酸于50 mL容量瓶中,用正己烷溶解并定容，得到浓度为400 μg/mL的标准溶液。
取20mL啤酒样品，超声振荡除气。让啤酒样品缓慢通过固相萃取小柱，然后用20mL正己烷-乙醚（体积比50∶50）将脂肪酸洗脱出来，滤入100 mL梨形瓶中，旋转蒸发器将其浓缩至1mL，转入10mL酯化管中。
在酯化管中加入0.1 mL 14%的三氟化硼-甲醇溶液，在95℃酯化20 min，再加入2 mL水及2 mL正己烷，振荡分层,收集有机相，用真空旋转蒸发器浓缩至1.0 mL，待测定。在这种酯化条件下，只有游离的脂肪酸能够被甲酯化，而以甘油三酯和磷脂形式存在的脂肪酸不会被酯化[5]。
色谱柱 DB-FFAP（30 m×0.32 mm×0.50 μm）；柱温80℃，程序升温8℃/min，至220℃下保持10 min；进样口温度240℃；载气He，柱流量0.8 mL/min；进样模式：不分流进样。
EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围29 u～400 u，四极杆温度150℃，离子源温度230℃，电子倍增器电压1 500 V，GC/MS接口温度280℃，检索谱库为Nist11.L。
分别将脂肪酸甲酯标准溶液和经处理的啤酒样品0.2 μL注入到气相色谱/质谱联用仪，根据质谱特征离子[21]及标准品色谱保留时间得到的总离子流图进行定性分析。啤酒样品1的总离子流图见图1。
分别将定性出来的脂肪酸甲酯的峰面积与标样的峰面积比较，单点法定量，其结果见表1。
由于啤酒的基质比较复杂，方法的准确性可以通过考察回收率和精密度等来完成。
图1 啤酒样品1的总离子流图
Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of the beer sample 1
表1 不同啤酒样品游离脂肪酸含量
Table 1 The content of free fatty acids in beer samples
为了评价方法的准确性，首先测试啤酒样品中天然存在的各种脂肪酸的浓度，然后添加一定加标水平的脂肪酸（辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸、油酸），按试验方法处理后进行测试，然后测试加入脂肪酸后啤酒中各脂肪酸浓度，进而得到其回收率，同时进行6个平行样品测试，计算该方法的相对标准偏差（RSD），结果见表2。
从表2可以看出，各脂肪酸在不同的加标浓度下都能获得较高的回收率（78.1%～93.5%），标准偏差为2.2%～3.8%，试验精密度较高，说明该方法能准确测定啤酒中的游离脂肪酸含量。
表2 回收率和精密度试验结果
Table 2 Recovery and precision
中链饱和脂肪酸（如辛酸和月桂酸）中极性基团部分相对较小，非极性脂肪链部分使之更像非极性化合物，因此，非极性溶剂正己烷也非常适合提取饱和中链和断链脂肪酸，需要通过使用不同比例的正己烷-乙醚来确定最佳提取溶剂。
首先测试啤酒样品中天然存在的各种脂肪酸的浓度，然后添加一定数量的各种脂肪酸（2.0 mg），选择不同溶剂按试验方法提取后进行测试，得到加入脂肪酸后啤酒中各脂肪酸浓度，进而得到其回收率，结果见图2。
图2 不同溶剂各种脂肪酸回收率
Fig.2 Recovery of fatty acids using different solvents
由图2可以看出，采用正己烷-乙醚（50∶50，体积比）作为提取溶剂时各种脂肪酸的回收率最高（辛酸82.1%，癸酸84.2%，月桂酸88.4%，棕榈酸89.8%，油酸93.5%）。其中中短链脂肪酸的回收率偏低，特别是辛酸，这可能由于辛酸的碳数相对比较少，相对极性偏大，使辛酸更容易留在水相而不容易被萃取出来。
本文提出用固相萃取法提取、气相色谱/质谱法进行定性分析并外标法定量检测啤酒中脂肪酸含量的方法，可以克服啤酒中游离脂肪酸含量极少，采取常规的提取方法难以满足检测要求的问题。通过对方法回收率和精密度的考察，结果表明各脂肪酸在不同的加标浓度下都能获得较高的回收率（78.1%～93.5%），标准偏差为2.2%～3.8%，试验精密度较高。比较不同比例提取溶剂对各种脂肪酸回收率的研究，发现采用正己烷-乙醚（体积比50∶50）作为提取溶剂时提取效率相对最高（辛酸82.1%、癸酸84.2%、月桂酸88.4%、棕榈酸89.8%、油酸93.5%），说明该方法能准确测定啤酒中的游离脂肪酸含量。该方法具有萃取时间短，减少了有毒溶剂的使用，且萃取结果不受乳化效果的影响等优点，并提供了自动化的可能性，是啤酒中游离脂肪酸分析的理想方法。
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Determination of Free Fatty Acids in Beer by Gas Chromatography-Mass Spectrometry
ZHOU Yi-bo，ZHU Zhi-xin*，LIANG Yong-wei，HUANG Ying-Hui
（Guangdong Provincial Public Laboratory of Analysis and Testing Technology，China National Analytical Center（Guangzhou），Guangzhou 510070，Guangdong，China）
Abstract：The content of free fatty acids in beer has important influence to its flavor.The free fatty acids in beer sample were extracted using solid phase extraction method，and then they were esterified and analyzed by GCMS.The recovery was conducted by adding a certain amount of fatty acid（caprylic acid，capric acid，lauric acid，palmic acid and oleic acid），and the result illustrated that relative high recovery can be obtained（78.1%-93.5%）with the relative sandard deviation（RSD）were 2.2%-3.8%.The results showed that the extraction efficiency was the highest when n-hexane-ethyl ether（50 ∶50 Volume ratio）was selected as the extractive solvent.This method has the advantage of fast operation，reliable，low solvent consumption and high recovery，and it can meet the requirements of the analysis of free fatty acids in beer.
Key words：gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；recovery；beer；free fatty acids
收稿日期：2017-05-17
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.031
作者简介：周漪波（1981—），男（汉），助理研究员，硕士，主要从事食品质量与安全方面的研究。
*通信作者：朱志鑫（1977—），男，高级工程师，硕士，主要从事食品质量与安全方面的研究。