申希峰，黄杰涛，张莲姬*
（延边大学理学院，吉林延吉133000）
摘 要：探讨蒽酮-硫酸法测定多糖含量的影响因素，并优化榛花多糖含量测定的最佳条件。试验以吸光度值为评价指标，检测波长为625 nm，对蒽酮质量浓度、加热温度、蒽酮试剂用量和加热时间进行单因素试验，再用L9（34）正交试验设计优选测定条件。结果表明，1 mL样液下，蒽酮质量浓度20 mg/mL、加热温度90℃、蒽酮试剂用量4.0 mL、加热时间10 min的条件最优。最佳工艺下，平均回收率为99.63%，相对标准偏差（RSD）为1.58%。
关键词：榛花；多糖；蒽酮-硫酸法；条件优化
榛花为桦木科（Butelaceae）植物榛Corylus heterophyllaFisch.ex Bess的雄花[1]，主要分布在东北、华北、西北、华东以及西南地区[2]。棒花具有消炎、消肿、止痛作用，可用于皮肤炎症、冻伤等[3]。多糖具有多种生物活性，包括免疫调节[4]、抗肿瘤[5]、降血脂[6]、降血糖[7]、抗辐射[8]、抗菌抗病毒[9]等。目前已经有榛花抗菌活性[10]与降血糖[11]作用的研究报道，但关于榛花多糖的相关研究鲜见报道。
目前，多糖的测定方法有多种方法，如苯酚-硫酸法[12]、酶法[13]、高效液相色谱法[14]和蒽酮-硫酸法等。酶法与高效液相色谱法需要多糖标准样品、特定的酶以及较昂贵的仪器，在应用中受到限制[15]，对于有色样品中多糖的测定，苯酚-硫酸法较于蒽酮硫酸法所受到的影响更大[16]。蒽酮-硫酸法快速且无需精密仪器，对有色样品中多糖测定影响较小，应用比较广泛。蒽酮-硫酸法的测定原理是多糖在浓硫酸的作用下水解为单糖，并迅速脱水生产糠醛衍生物，其与蒽酮结合生成有色化合物。因为不同的含糖物质测定条件均有所不用等特点，导致蒽酮－硫酸法存在一定波动性[17]，如果只考虑一般文献的测定条件，可能会造成较大的误差。因此为提高榛花多糖含量测定结果的准确性，本文应用蒽酮—硫酸法建立榛花多糖含量的测定方法，并分别观察蒽酮质量浓度、加热温度、蒽酮试剂用量与加热时间对榛花多糖水解的影响，再通过正交法优选其最佳测定条件。
榛花：采集于吉林省长白山，晒干后粉碎，过60目筛。
蒽酮：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸：天津市东丽区天大化学试剂厂；葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；石油醚：辽宁泉瑞试剂有限公司；以上试剂均为分析纯。
HH-2数显恒温水浴锅、80-2台式离心机：金坛市科析仪器有限公司；T6新世纪紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；CP114电子天平：奥豪斯仪器；RE-52旋转蒸发仪：上海青埔沪西仪器厂；DGF-4A型立式电热鼓风干燥箱：天津市泰斯仪器有限公司。
干燥的榛花粉采用索氏提取器，分别以无水乙醚和无水乙醇处理至回流液的颜色接近无色。准确称取已处理的1.000 g榛花粉，加入30 mL的蒸馏水，80℃水浴提取 2 h，离心（3 500 r/min）20 min，上清液浓缩后加入4倍体积的无水乙醇放置过夜，沉淀冷冻干燥得到粗多糖，并加水定容到1 000 mL。
方法参见文献[18-19]。
取1.2.1方法得到的多糖样品溶液1 mL，加入到10 mL比色管中，加入一定质量分数与体积的蒽酮试剂，在一定的温度下，加热一定的时间后用冰水冷却10 min，在625 nm处测定其吸光度值。利用标准曲线方程计算样品中多糖的含量[20]。多糖含量：
式中：C为测得的样品溶液中葡萄糖浓度，%；D为样品溶液稀释倍数；f为换算因子1.274；W为榛花干粉质量，g。
依次进行榛花多糖蒽酮质量浓度、加热温度、蒽酮试剂用量与加热时间的单因素试验，每个单因素试验所得到的最优值为下一组单因素试验的固定条件。
第一组的固定因素是加热温度100℃，蒽酮试剂用量4.0 mL，加热时间15 min，这时的单因素变量是蒽酮质量浓度，5 组为 10、15、20、25、30 mg/mL。
第二组的固定因素是质量浓度20 mg/mL，蒽酮试剂用量4.0 mL，加热时间15 min，这时的单因素变量是加热温度，5 组为 60、70、80、90、100 ℃。
第三组的固定因素是质量浓度20 mg/mL，加热温度100℃，加热时间15 min，这时的单因素变量是蒽酮试剂用量，5 组为 2、4、6、8、10 mL。
最后一组的固定因素是质量浓度20 mg/mL，加热温度100℃，蒽酮试剂用量4.0 mL。这时的单因素变量是加热时间，5 组为 5、10、15、20、25 min。
在上述单因素试验的基础上，以多糖含量为评价指标，进行四因素三水平的正交试验，得出最佳测定条件。试验按L9（34）正交表设计，见表1。
表1 因素水平表
Table 1 Orthogonal design table
吸取榛花多糖样品液1.0 mL，由1.4确定的最佳测定条件下平行5次测定，计算相对标准偏差，并分析其重现性。
分别吸取榛花多糖样品液1.0 mL 3份于50 mL锥形瓶中，按1.4确定的最佳测定条件下测定吸光度。另取3份榛花多糖溶液1.0 mL于50 mL锥形瓶中，分别加入1.0 mL葡萄糖标准溶液由1.4确定的最佳测定条件下测定吸光度，按下式计算加标回收率。
回收率/%=（加标试样测定值-试样测定值）/加标量×100
蒽酮质量浓度对多糖吸光度的影响见图1。
图1 蒽酮质量浓度对多糖吸光度的影响
Fig.1 Effect of anthrone concentration on the absorbance of polysaccharides
由图1可知，当蒽酮试剂质量浓度在10 mg/mL～20 mg/mL之间，吸光度随蒽酮试剂质量浓度的增加而增加，当质量浓度大于20 mg/mL后，其吸光度开始下降。因此，确定蒽酮试剂质量浓度为20 mg/mL。
加热温度对多糖吸光度的影响见图2。
图2 加热温度对多糖吸光度的影响
Fig.2 Effect of heating temperature on the absorbance of polysaccharides
由图2可知，随着加热温度的提高，多糖的吸光度也随着增加，在90℃时达到最大值，之后随着加热温度的继续提高，吸光度开始下降，因此确定最优的加热温度为90℃。
蒽酮试剂用量对多糖吸光度的影响见图3。
图3 蒽酮试剂用量对多糖吸光度的影响
Fig.3 Effect of anthrone reagent on polysaccharide absorbance
蒽酮试剂使用量不同，对榛花多糖的显色效果也不同，用量在2.0 mL～4.0 mL时，随着用量的增加，吸光度开始增加，当蒽酮试剂用量为4.0 mL时，样品吸光度达到最大。随后再增加蒽酮试剂的用量，吸光度开始下降。因此，确定蒽酮试剂最佳用量为4.0 mL。
加热时间对多糖吸光度的影响见图4。
图4 加热时间对多糖吸光度的影响
Fig.4 Effect of heating time on the absorbance of polysaccharides
由图4可知，随着加热时间的增加，吸光度先增加后减少，其原因是浓硫酸多糖的水解作用，需要一定时间后才能反应完全，因此吸光度会先增加。同时又因为浓硫酸的强氧化作用，破环了反应产物的结构，造成吸光度减小。所以最佳加热时间为10 min[23]。
在单因素试验结果的基础上，设计了四因素三水平的正交试验，试验结果见表2。
表2 L3（34）正交试验结果
Table 2 Results and analysis of orthogonal test
从表2L9（34）正交试验极差分析结果可以推断出，蒽酮试剂用量对吸光度的影响最大，是影响测定多糖含量的最主要因素；也可以在表格里得到这样的信息：蒽酮试剂用量影响程度最高，其次是蒽酮质量浓度，然后是加热时间，最后是加热温度；且测定榛花多糖含量的最好的因素组成是A2B2C2D2，而试验测定结果中，吸光度最大的组合为A1B2C2D2，因此对这两组进行了比较，其结果见表3。
由表3可知，A2B2C2D2组合优于A1B2C2D2，所以最佳测定条件是A2B2C2D2，蒽酮质量浓度为20 mg/mL，加热温度为90℃，蒽酮试剂用量为4.0 mL，加热时间为10 min。
表3 试验组的吸光度比较结果
Table 3 The result of samplesp absorbance
以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制的标准葡萄糖曲线见图5。
图5 葡糖糖标准曲线
Fig.5 Glucose standard curve
图5可以看出，其回归曲线为y=0.010 5x-0.062 2，相关系数r值为0.997 4，可得葡萄糖浓度在20 μg/mL～100 μg/mL的质量范围内有较好的线性关系。
精密度测定结果分析见表4。
表4 精密度测定结果分析
Table 4 Precision measurement result analysis
由表4可知，榛花多糖溶液重复测定5次试验的RSD（n=5）值为1.17%，可知精密度良好。
回收率试验结果见表5。
表5 回收率试验结果
Table 5 Recovery experimental results
由表5可得，该试验方法的平均回收率为99.63%，相对标准偏差RSD为1.58%，说明该方法是准确可靠的。
按1.2.3方法计算多糖含量，代入2.4里5次试验的平均吸光度值0.537，从而计算得到榛花多糖中总糖含量为5.71%。
本试验先通过在单因素的基础上，再采用正交法对蒽酮—硫酸法对榛花多糖的测定条件进行优化。试验结果的最佳显色条件是：1 mL样液下，蒽酮质量浓度20 mg/mL、加热温度90℃、蒽酮试剂用量4.0 mL、加热时间10 min的条件最优，其加标回收率为99.63%，相对标准偏差（RSD）为1.58%，测定样品中的多糖含量为5.71%。该方法的稳定性与重复性好，简单快速，适用于榛花中多糖的测定，为榛花多糖的进一步开发利用提供了理论依据。
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Determination of Optimal Conditions of Polysaccharide Content of Hazel's Flower by Anthrone Sulfuric Acid Method
SHEN Xi-feng，HUANG JIE-tao，ZHANG Lian-ji*
（College of Science，Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）
Abstract：To optimize the content determination conditions ofCorylus hecerophyllapolysaccharide by anthrone-sulfuric acid method.Anthrone-sulfuric acid method was used for content determination glucose as parameters.The absorbance was measured at 625 nm.A single factor test was performed on the concentration，heating temperature，anthrone reagent dosage and heating time.L9（34）orthogonal design was chosen for optimum measuring conditions.The results showed that 10 min reaction at 90℃in the presence of 4.0 mL of 20 mg/mL anthrone reagent was found to be optimal in 1mL sample fluid.The average recovery was up to 99.63%，and the RSD was 1.58%.
Key words：Hazel's flower；polysaccharide；anthrone-sulfuric acid method ；process optimization
收稿日期：2016-12-26
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.030
基金项目：延边大学2016年大学生创新创业训练计划项目（ydbksky2016102）
作者简介：申希峰（1995—），男（朝鲜），在读本科，研究方向:天然产物的提取及活性。
*通信作者：张莲姬（1970—），女，副教授，研究方向：天然产物的提取及活性。