图1 水提物原UPLC检测图谱
Fig.1 The original UPLC chromatogram of water extract
额尔敦巴雅尔1，2，赵鹏宇1，2，焦利卫1，2，徐建中1，2，连运河1，2，*
（1.河北省天然色素工程技术研究中心，河北邯郸 057250；2.晨光生物科技集团股份有限公司，河北邯郸057250）
摘 要：为详细了解甜叶菊水提物和絮凝上清液的化学成分差异，建立超高效液相-串联四级杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）分析方法并在此基础上对两种样品成分进行分析比较。研究结果表明，此方法可有效地将各种化合物分离开来，利用此方法检测比较得出，甜叶菊水提物和絮凝上清液化学成分差异显著，甜叶菊水提物中69种化合物经絮凝后上清液中只含有35种化合物。就去除种类而言，絮凝过程去除绿原酸类和去除黄酮类物质较为显著。
关键词：超高效液相-串联四级杆飞行时间质谱；甜叶菊；水提物；絮凝上清液；化学成分
甜叶菊（Stevia rebaudiana）又称甜菊、甜草、糖草，为菊科植物，是极好的糖源和营养来源[1]。甜叶菊最主要的价值为甜叶菊叶片中含有的甜菊糖苷，含量达6%～12%，甜菊糖苷具有热量低、甜度高、味质好、耐高温、稳定性好等特点[2]。甜菊糖苷提取方法主要有水浸提法[3-4]、溶剂萃取法[5]、连续逆流提取法和超声提取法[6]，它们各有优缺点，从生产实际出发，选择水作为溶剂浸提，用无毒又廉价的盐作为絮凝剂，采用离子交换树脂法进行提取精制。本工艺的第一步为水浸提甜菊叶，水提物中含有大量的水溶性杂质，因此需要絮凝来去除水溶性杂质。但絮凝工艺去除的成分即水提物与絮凝沉淀上清液化学成分差异还未见报道，本文就此问题进行分析研究。
甜菊叶水提物及絮凝上清液中成分复杂，采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）技术很难将多种成分分离开，仅仅局限于检测主要糖苷和几个主要的绿原酸含量[7-8]，而UPLC-QTOFMS技术在化学成分分析上有着举足轻重的作用，其中超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）有着强大的分离作用，是目前分离复杂成分最有效的方法之一，与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9、3、1.7倍。而超高效液相色谱与四级杆飞行时间质谱（Quadrupole time of flight mass spectrometry，QTOF-MS）联用对天然产物成分分析起到极大的推动作用，QTOF-MS可在宽质量范围内实现高分辨，得到物质准确的分子量；能够获得真实的同位素峰形分布，得到未知物的分子式，具有高灵敏度、高选择性以及高效快速的特点[9]。因此本文采用UPLC-QTOF-MS技术对两种样品进行化学成分差异分析，原有的UPLC方法主要用于检测甜菊糖的9种糖苷，无法将其它物质有效地分离，本文在原有的基础上，改良UPLC条件，建立UPLC-QTOF-MS分析方法，在此基础上分析甜叶菊水提物与絮凝上清液两种样品的成分差异。
干燥的甜叶菊叶：内蒙；FeSO4、Ca（OH）2：天津市泰兴试剂厂；甲酸（HPLC级）、乙腈（HPLC级）：天津市北方天医化学试剂厂；超纯水。
色谱柱SAgilentPoroshell 120 SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），采用 Acquity UPLC 与 G2 QTOF联用系统：美国Waters公司。
市面上购买干燥的甜叶菊叶，60℃下进行水提3 h，料液质量比为1∶18，过滤得水提物；取1L水提物，在其中加入 9 gFeSO4和 4.5 gCa（OH）2絮凝，絮凝液pH值控制在9.0～10.0，过滤所得上清液干絮凝上清液，将上述水提物和絮凝上清液进行UPLC-QTOF-MS分析。
色谱柱为SAgilentPoroshell 120 SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；柱温 40℃；梯度洗脱溶剂A为0.5%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序如下：20%A（0～2 min），20%～35%A（2 min～20 min），35%A（20 min～25 min），35%～50%A（25 min～35 min），50%～100%A（35 min～45 min），100%A（45 min～48 min），100%～20%A（48 min～48.1 min），20%A（48.1 min～50 min）；流速为 0.4 mL/min；进样量为 10 μL。
电喷雾电离（ESI）离子源，质量扫描范围（m/z）100～2 000，毛细管电压为 3 kV（负离子模式），样品锥电压40 V，提取锥电压4 V，源温110℃，脱溶剂气温度300℃，脱溶剂气流速度700 L/h。
原有的检测9种甜菊糖苷的UPLC条件为：色谱柱SAgilentPoroshell 120 SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流动相为水 ∶乙腈 =68 ∶32；流速：1.0 mL/min；检测波长：210 nm；进样量：10 μL；柱温：40℃。图1为用于检测甜菊糖9种糖苷的UPLC条件下的检测图谱，可以看出此检测方法虽可以有效地将9种糖苷分离开来，但其他物质的峰较少且不能较好的分离；水提物改良后HPLC图谱见图2，如图2所示，改良后的UPLC条件可以有效地将各种物质分离开来。
采用改良后的UPLC分离条件可以有效地将甜菊叶水提物中各化学成分分离开来，在UPLC-QTOF-MS条件下得到质谱图，通过碎片离子峰及与文献报道[10-21]比较，共确定得出64种化合物，对化合物进行分类得，甜菊糖类28种、绿原酸类10种、黄酮类12种、氨基酸类5种、其它类物质9种。详细结果见表1。
图1 水提物原UPLC检测图谱
Fig.1 The original UPLC chromatogram of water extract
图2 水提物改良后UPLC图谱
Fig.2 The improved UPLC chromatogram of water extract
絮凝上清液UPLC图谱见图3。
如图3所示，采用改良后的UPLC分离条件可以有效地将甜叶菊絮凝上清液中各化学成分分离开来，在UPLC-QTOF-MS条件下得到质谱图，通过碎片离子峰及与文献报道[10-21]比较，共确定得出35种化合物，对化合物进行分类得，甜菊糖类19种、绿原酸类4种、黄酮类5种、氨基酸类3种、其它类物质4种。详细结果见表2。
表1 水提物检出成分
Table 1 The detected components of water extract
续表1 水提物检出成分
Continue table 1 The detected components of water extract
通过对甜叶菊水提物与絮凝上清液的化学成分比较得出，甜叶菊水提物中检测到而絮凝上清液中没有检测到的物质有34种，其中甜菊糖类11种、绿原酸类6种、黄酮类10种、氨基酸类2种，其它类5种，详细结果见表3。
图3 絮凝上清液UPLC图谱
Fig.3 The UPLC chromatogram of flocculation supernatant
表2 絮凝上清液检出的成分
Table 2 The detected components of flocculation supernatant
表3 水提物较絮凝上清液中多检出成分
Table 3 The detected additional components of water extract more than flocculation supernatant
除此之外，絮凝上清液较水提物多检出成分见表4。
如表4所示，絮凝上清液中所检测到的物质中还有2种甜菊糖类、3种黄酮类共5种化合物在甜菊叶水提物中没有检出，因絮凝过程没有加入有机物，故絮凝上清液中有机成分均来自甜叶菊水提物，因此说明絮凝上清中额外检出的5种化合物在水提物中检测时没有与其它物质峰分离开来，此5种物质也应归甜叶菊水提物所含成分。
表4 絮凝上清液较水提物多检出成分
Table 4 The detected additional component of flocculation supernatant more than water extract
改良UPLC条件，建立的UPLC-QTOF-MS检测方法可以有效地将各种化学成分分离开来，甜叶菊水提物中共发现化合物64种，絮凝上清液中又多发现出5种化合物，因此可认为甜叶菊水提物中发现69种化合物，而絮凝上清液中共发现35种化合物。甜叶菊水提物与絮凝上清液中相差34种化合物，其中30种甜菊糖类中去除了11种，甜菊糖中9种主要糖苷均未被去除，10种绿原酸类去除了6种，15种黄酮类去除了10种，5种氨基酸类去除了2种。就去除种类而言，絮凝过程去除绿原酸类和去除黄酮类物质较为显著。
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The Study of the Differences of Compositions between Water Extract and Flocculation Supernatant from Stevia rebaudiana
Eerdunbayaer1，2，ZHAO Peng-yu1，2，JIAO Li-wei1，2，XU Jian-zhong1，2，LIAN Yun-he1，2，*
（1.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments，Handan 057250，Hebei，China；2.Chenguang Biotech Group Limited Corporation，Handan 057250，Hebei，China）
Abstract：An ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLCQTOF-MS）method was developed for more information about the chemical composition differences of stevia extract and flocculation supernatant.The results indicated that the various compounds had been separated effectively by this method.There were 69，35 compounds which were detected in water extract and flocculation supernatant，respectively.The results also indicated that more chlorogenic acid and flavonoids could be removed than other components by flocculation process.
Key words：ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry（UPLCQTOF-MS）；Stevia rebaudiana；water extract；flocculation supernatant；chemical composition
收稿日期：2016-12-16
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.029
基金项目：河北省重大科技成果转化专项（16047101Z）
作者简介：额尔敦巴雅尔（1985—），男（蒙古），博士，研究方向：天然产物化学。
*通信作者：连运河（1972—），男（汉），正高级工程师，大专，研究方向：天然产物化学。