表1 正交试验设计表
Table 1 Design of orthogonal test
鞠璐宁，黄妍，吴航，曹星
（闽北职业技术学院，福建南平353011）
摘 要：为遴选蜂蜜醋发酵的最佳工艺参数，了解不同醋酸菌发酵蜂蜜的特性，在液态发酵法制备蜂蜜醋时，研究酒精度、接种量和pH值对产酸量的影响。通过单因素和正交试验，得出最佳工艺参数为：许氏醋酸杆菌为酒精度6%VOL、接种量15%、pH 6.0，巴氏醋酸杆菌为酒精度4%VOL、接种量10%、pH 5.0，巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）为酒精度6%VOL、接种量10%、pH 6.0，恶臭醋酸杆菌为酒精度6%VOL、接种量10%、pH 6.0，混变种ASl.41醋酸菌为酒精度6%VOL、接种量15%、pH 5.0。
关键词：蜂蜜醋；醋酸菌；比较
果醋饮料是以果蔬为主要原料进行二次发酵制成的新型饮料，被誉为“第六代黄金饮品”[1]。我国的果醋饮料产品主要有两种，一种是单一果醋，如由苹果[2]、葡萄[3]、椰枣[4]、山楂[5]、西瓜[6]、葛根[7]、豆薯[8]、怀山药[9]等单一果蔬发酵的产品，另一种是混合汁，即以混合果汁发酵而成，如雪莲果、西番莲[10]，苹果、葡萄和梨汁等混合发酵的产品[11]。
蜂蜜醋是以蜂蜜为原料，经发酵制备成的醋，是醋酸饮料的一种，具有香味独特、口感醇和、保留蜂蜜的活性成分、香味和营养价值的同时富含有醇、醋、酯、有机酸、氨基酸、维生素等活性物质[12-14]。采用液态发酵法进行[15]，经酵母菌酒精发酵，醋酸菌醋酸发酵制成。果醋的发酵菌种是决定果醋饮料品质的关键因素之一，国外常用醋酸菌种为奥尔兰醋酸杆菌（Aceto－bacter orleanense）、许氏醋酸杆菌（Acetobacter schutzenbachii），国内常用醋酸菌种为恶臭醋酸杆菌（Acetobacter rancens）、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）（Acetobacter pasteurianussubsp.pasteurianus）、混变种 ASl.41 醋酸菌（Acetobacterrancensvar.tubidans）。然而，以往研究多集中在工艺研究和原料适宜性方面[16-17]，且采用单一醋酸菌种或多菌种共生发酵[18]制备。本文通过比较许氏醋酸杆菌、巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌、混变种ASl.41醋酸菌等5种菌株在不同酒精度、接种量、pH值等实验条件下所制备蜂蜜醋的产酸、产酯等方面的特性，以期选择制备蜂蜜醋适宜的发酵条件及醋酸菌种。
椴树蜂蜜、枣花蜂蜜、龙眼蜂蜜：福建省神蜂科技开发有限公司；安琪葡黄酒高活性干酵母：市售；许氏醋酸杆菌、巴氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）：上海迪发酿造生物有限公司；恶臭醋酸杆菌、混变种ASl.41醋酸菌：通派（上海）生物科技有限公司。
蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉等均为生物试剂：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、柠檬酸、磷酸二氢钠、无水乙醇、氢氧化钠、磷酸铵等均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。
85-2恒温磁力搅拌器：上海江星仪器有限公司；数显式酸度计：上海精宏实验设备有限公司；BX5200L HP超声波清洗器：上海新苗医疗器械制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HH4-电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；1000W电子调温电炉：江阴市保利科研器材有限公司；BT125 D电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；WTY型手持糖量计：泉州化学仪器厂。
酵母菌的活化[19]：取安琪葡萄酒高活性干酵母接入含糖量2%蜂蜜溶液中，置于30℃恒温培养18 h。
醋酸菌的活化：分别将许氏醋酸杆菌、巴氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌、混变种ASl.41醋酸菌5种醋酸菌接入酒精度为4%VOL蜂蜜酒中，加入硫酸铵0.1 g/L，磷酸铵0.5 g/L，柠檬酸钾0.1 g/L，硫酸镁0.1 g/L，在30℃，200 r/min的恒温摇床中培养18 h。
据李若彤[20]研究，椴树蜂蜜溶液（质量比为31%）、枣花蜂蜜（49%）、龙眼蜂蜜（15%）在体积比为4∶4∶2下所制蜂蜜醋感官评价最佳。故采用该配比制备混合蜂蜜溶液，并用蒸馏水稀释，调整最终蜂蜜液含糖量至15%，于80℃水浴中灭菌15 min。
发酵前调整蜂蜜的pH值至5.0，加入适量的磷酸铵满足酵母菌所需的氮源。
将活化后的混合酵母菌，接种于含糖量15%，pH 5.0的灭菌蜂蜜稀释液中，接种量1.5%，30℃恒温培养箱中发酵待蜂蜜液中不再产生气泡停止发酵，测定含糖量、酒精含量、酯含量。
本试验主要比较了显著影响醋酸菌生长的酒精度、接种量、pH值3个因素。
1.2.5.1 不同醋酸菌发酵蜂蜜醋适宜酒精度比较
蜂蜜酒酒精度调整为 2%VOL、4%VOL、6%VOL、8%VOL，分别接种10%的许氏醋酸杆菌活化液至蜂蜜酒溶液中，pH值为6.0，摇床温度32℃，转速180 r/min条件下进行发酵，发酵结束测定产酸量。
巴氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌、混变种ASl.41醋酸菌发酵方法同上。
1.2.5.2 不同醋酸菌发酵蜂蜜醋适宜接种量比较
蜂蜜酒液pH值调至6.0，酒精度调至4%VOL，摇床温度32℃，转速180 r/min条件下，分别将5%、10%、15%、20%的许氏醋酸杆菌进行发酵，发酵结束测定产酸量。
巴氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌、混变种ASl.41醋酸菌发酵方法同上。
1.2.5.3 不同醋酸菌发酵蜂蜜醋适宜pH值比较
将蜂蜜酒液酒精度调整为4%VOL，pH值调整为4.0、5.0、6.0、7.0，许氏醋酸杆菌接种量为 10%，摇床温度为32℃，转速180 r/min条件下进行蜂蜜醋发酵，发酵结束测定产酸量。
巴氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌、混变种ASl.41醋酸菌发酵方法同上。
1.2.5.4 不同醋酸菌发酵蜂蜜醋适宜酒精度、接种量、pH值正交试验
在单因素试验的基础上，确定醋酸菌发酵蜂蜜醋的主要影响因素。正交试验因素水平的设计见表1，以发酵后的产酸量为指标，在摇床温度为32℃，转速180 r/min条件下进行L9（34）正交试验。
表1 正交试验设计表
Table 1 Design of orthogonal test
酒精度：GB/T394.2-2008《酒精通用分析方法》[21]；pH值：pH计法；总糖度：手持糖量仪测定；醋酸含量：酸碱滴定法[22]。
蜂蜜酒发酵过程中酒体的优劣与酵母菌种类、接种量、发酵温度及蜂蜜品种等有直接关系。发酵温度过高会影响蜂蜜酒的口感和香气成分，温度过低则发酵时间较长。蜂蜜因蜜源植物不同含糖量和香气成分亦不同，品质较好的蜂蜜含糖量适中，香味扑鼻，深加工成蜜酒不仅含有原蜂蜜的香味也产生新的芳香成分。蜂蜜酒发酵结束后残糖量、酒精度、挥发酯、感官评价结果如表2。
表2 蜂蜜酒残糖、酒精度、挥发酯含量
Table 2 The content of residual sugar，alcohol and volatile ester of honey wine
从表2可以看出，葡萄酒高活性干酵母发酵的蜂蜜酒，发酵充分从残糖、酒精度、挥发酯、口感都比较好，说明葡萄酒高活性干酵母适合蜂蜜酒的酿制与文献报道[23]相符合。
发酵蜂蜜醋的优劣与蜂蜜醋酒精度、接种量、初始pH值、发酵温度及蜂蜜品种等因素关系密切，通过单因素和正交试验比较酒精度、接种量和初始pH值对发酵蜂蜜醋的影响，比较不同品种醋酸菌发酵蜂蜜醋的特性。
醋酸菌的主要特征是氧化酒精生成醋酸。醋酸菌对酒精适应环境及耐受力不一样，酒精度低醋酸菌不能充分生长，酒精度过高反而会抑制醋酸菌生长和产酸，酒精转化率都会降低。试验中以酒精度为变量，保持其他发酵因素恒定，以产酸量为指标。分别比较了5种醋酸菌的产酸状况，结果如图1所示。
由图1可知，在2%VOL至8%VOL酒精度范围内，产酸量是先升高后下降，许氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌、混变种ASl.41醋酸菌在酒精度为6%VOL时产酸量达到最大值，巴氏醋酸杆菌在酒精度为4%VOL时产酸量达到最大值。
醋酸菌醋酸发酵过程中接种量是影响发酵成功与否的另一关键因素。醋酸菌的接种量过少则不能立即形成生长优势，易污染杂菌使菌生长环境变差；接种量过多，就会使得发酵过程加快，醋酸菌大量繁殖后迅速衰退，发酵不充分新生成物质少，醋酸风味得不到丰富。试验中以接种量为变量，在酒精度为4%VOL，pH值为6时，保持其他发酵因素恒定，以产酸量为指标。分别比较了5种醋酸菌的产酸状况，结果如图2所示。
图1 不同酒精度醋酸菌产酸量
Fig.1 Producing vinegar amount when different alcohol percentage
图2 不同菌种接种量醋酸菌产酸量
Fig.2 Various strains producing acid when inoculation amount
由图2可知，在5%至20%接种范围内，产酸量是先升高后下降，巴氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌在接种量为10%时产酸量最大。许氏醋酸杆菌和混变种ASl.41醋酸菌在15%时产酸量最大。
醋酸菌在醋酸发酵过程中不仅与酒精度、接种量有关，还与发酵液的pH值有关且直接影响醋酸菌的生长和产酸量。醋酸发酵初期发酵液中适量的醋酸既能促进产酸，又能抑制杂菌的生长。因此，适宜pH值有助于促进蜂蜜醋的蜂蜜。试验中以pH值为变量，保持其他发酵因素恒定，以产酸量为指标。分别比较了5种醋酸菌的产酸状况，结果如图3所示。
由图3可知，各菌种在pH值从4.0到7.0时产酸量是先升高后下降，巴氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌、混变种ASl.41醋酸菌随着pH值的增加产酸速度再增加，许氏醋酸杆菌的产酸速度明显小于前4种醋酸菌；巴氏醋酸杆菌和混变种ASl.41醋酸菌在pH值为5.0时产酸量达最大。许氏醋酸杆菌、巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌在pH值6.0时产酸量达最大。
图3 不同pH值醋酸菌产酸量
Fig.3 Produce acid conditions of different pH value
通过正交试验比较酒精度、接种量和pH值对产酸量的影响，根据表3、表4发现，各因素影响的主次顺序因菌种不同而存在差别，其中，许氏醋酸杆菌和巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）发酵时，各因素的主次顺序为酒精度＞初始pH值＞接种量，与李若彤[20]、周文俊[24]研究结果一致；其他菌种时，主次顺序为酒精度＞接种量＞初始pH值，与马荣山[17]、张丽珍[19]研究结果一致，各因素的显著性均为极显著水平，所以其影响非常显著，且方差分析与极差分析结果一致，可见酒精度对跟菌种的发酵试验的影响最大。不同菌种发酵的最佳工艺参数如下，许氏醋酸杆菌为酒精度6%VOL、接种量15%、pH 6.0；巴氏醋酸杆菌为酒精度4%VOL、接种量10%、pH 5.0；巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）为酒精度6%VOL、接种量10%、pH 6.0；恶臭醋酸杆菌为酒精度6%VOL、接种量10%、pH 6.0；混变种ASl.41醋酸菌为酒精度6%VOL、接种量15%、pH5.0。
表3 醋酸发酵正交结果表
Table 3 Orthogonal results tables of acetic fermentation
表4 醋酸发酵正交设计方差分析
Table 4 Orthogonal design anova table of acetic fermentation
经过单因素和正交试验，比较了醋酸发酵中常见的5种醋酸菌在蜂蜜醋发酵适宜的酒精度、醋酸菌接种量、pH值。结果表明：巴氏亚种（沪酿1.01醋酸菌）、恶臭醋酸杆菌最佳发酵条件一致其他醋酸菌最佳发酵条件存在差别，蜂蜜醋发酵是通过微生物的生长代谢完成，微生物的生长条件复杂而敏感，更复杂的试验因素和密集的试验梯度有待进一步研究。
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Comparison of Honey Vinegar Fermentation with Different Acetic Acid Bacteria
JU Lu-ning，HUANG Yan，WU Hang，CAO Xing
（Min Bei Vocational＆ Technical College，Nanping 353011，Fujian，China）
Abstract：The purposes of this study was to select the optimum technology conditions of honey vinegar fermentation，and realize honey vinegar fermentation with different acetic acid bacteria.Researching on the production of acid with different alcohol，inoculation and pH value on honey vinegar liquid fermentation.Through the single-factor tests and the orthogonal tests，the optimum conditions were obtained as follows:Acetobacter schutzenbachiialcohol 6%VOL，inoculation amount 15%，pH 6.0；Acetobacter pasteurianusalcohol 4%VOL，inoculation amount 10%，pH 5.0；Acetobacter pasteurianussubsppasteurianus（HuNiang 1.01）alcohol 6%VOL，inoculation amount 10%，pH 6.0；Acetobacter rancensalcohol 6%VOL，inoculation amount 10%,pH 6.0；Acetobacter rancens var.tubidans（ASl.41）alcohol 6%VOL，inoculation amount 15%，pH 5.0.
Key words：honey vinegar；acetic acid bacteria；comparison
收稿日期：2017-05-17
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.020
基金项目：福建省教育厅中青年教师教育科研项目（JB14190）
作者简介：鞠璐宁（1985—），女（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：食品加工。