叶春林，MUNYONHO Ferris Tatenda，黄盼盼，李嘉骏，经洁，方慧
（浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点试验室，浙江杭州310023）
摘 要：为优化仙鹤草中总黄酮的提取方法，在单因素试验基础上，选取提取时间、提取温度、乙醇浓度和料液比为自变量，仙鹤草总黄酮提取率为响应值，采用响应曲面试验设计方法，研究各自变量及其交互作用对总黄酮提取率的影响。采用Design-Expert软件，建立总黄酮得率与因素间的二次回归模型。结果表明：该回归模型极显著，预测性强。乙醇浓度和提取温度是影响提取率的主要因素；优化得到的最佳提取工艺条件：提取时间100 min、提取温度100℃、乙醇浓度30%、料液比1∶15（g/mL）。在此提取工艺条件下平行3次进行验证，总黄酮得率为9.92%。
关键词：仙鹤草；响应面法；黄酮；提取
仙鹤草（Herba Agrimoniae）为蔷薇科龙芽草（Agrimonia pilosa Ledeb.）的干燥地上部分[1]，又称金顶龙芽、龙芽草、脱力草、狼芽草等[2]。仙鹤草全草入药，中医临床主要用于止血、降糖、抗肿瘤、泌尿道、呼吸道、消化道等疾病的治疗[3]。仙鹤草主要含有鞣酸类、间苯三酚缩合体、黄酮类、有机酸、内酯和香豆素类成分[4-5]。近年来，研究发现，仙鹤草中含有芦丁、芹菜素、山奈酚、木犀草素等多种黄酮类化合物[6]，黄酮类化合物是一类具有多样生物活性的天然有机化合物，广泛存在于植物中[7]，具有降脂[8]、抗氧化[9]、降糖[10]等生物活性，日益成为医药工作者的研究热点。
本研究以仙鹤草总黄酮提取率为指标，采用响应曲面统计法优化其提取工艺，为仙鹤草的深加工及提高附加值提供理论基础。
仙鹤草：杭州市西湖区药房，粉碎过60目筛；芦丁标准品（光谱纯）、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠（均为分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。
BS2202S精密天平：SARTORIUS公司；752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；DKS-24型电热恒温水浴锅：杭州蓝天化验仪器厂。
参考文献[11]，求得总黄酮质量浓度（y，mg/mL）与吸光度（x）的标准曲线为y=0.085 3x-0.000 8，相关系数R2=0.999 3。再根据标准曲线，算出总黄酮类物质质量浓度。
按回归方程计算，按下式计算总黄酮的提取率：
式中：C为仙鹤草提取液总黄酮的质量浓度，mg/mL；n为提取液稀释倍数；V为提取液体积，mL；W为提取用仙鹤草的质量，mg。
1.2.2.1 提取时间考察
精确称取5份5 g仙鹤草粉于三口烧瓶中，分别加入体积分数为60%的乙醇各50 mL，在60℃恒温水浴锅中分别冷凝回流提取 30、60、90、120、150 min，趁热过滤，冷却后分别取2.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至25 mL。在506 nm紫外分光光度计下测定吸光度，计算黄酮提取率。比较不同提取时间的仙鹤草黄酮提取率，以确定提取时间较优取值。
1.2.2.2 提取温度考察
精确称取5份5 g仙鹤草粉于三口烧瓶中，加入50 mL体积分数为60%的乙醇溶液，分别在60、70、80、90、100℃恒温水浴锅中冷凝回流提取60 mim，趁热过滤，冷却后分别取2.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至25 mL。在506 nm紫外分光光度计下测定吸光度，计算黄酮提取率。比较不同提取温度下，仙鹤草黄酮的提取率，确定提取温度较优取值。
1.2.2.3 乙醇浓度考察
精确称取5份5 g仙鹤草粉于三口烧瓶中，分别加入50 mL体积分数为10%、20%、30%、40%、50%的乙醇溶液，在60℃恒温水浴锅中冷凝回流提取60 min，趁热过滤，冷却后分别取2.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至25 mL。在506 nm紫外分光光度计下测定吸光度，计算黄酮提取率。比较不同乙醇浓度的仙鹤草黄酮提取率，确定乙醇浓度较优取值。
1.2.2.4 料液比考察
精确称取5份5 g仙鹤草粉于三口烧瓶中，分别加入 60%的乙醇溶液各 50、75、100、125、150 mL，在60℃恒温水浴锅中冷凝回流提取60 min，趁热过滤，冷却后分别取2.5 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至25 mL。在506 nm紫外分光光度计下测定吸光度，计算黄酮提取率。比较各料液比下仙鹤草黄酮提取率，以确定料液比较优取值。
在单因素试验的基础上，采用响应曲面法对仙鹤草总黄酮的提取工艺进行优化，通过拟合二次多项式方程，计算出最佳工艺组合及在此条件下的总黄酮的最大提取率理论值。
应用Design-Expert 8.05b软件采用Central Composite Design（CCD）进行试验设计。以仙鹤草总黄酮提取率为指标，进行响应曲面分析。响应曲面因素与水平的确定见表1。
表1 响应曲面因素与水平表
Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design
通过软件分析获得最佳提取工艺条件后，按照优化条件进行提取测定，比较试验结果和方程计算值的差异。
提取时间对仙鹤草黄酮提取率的影响如图1所示。
图1 提取时间对总黄酮提取率的影响
Fig.1 Effect of the extraction time on the yield of total flavonoids
由图1可见，随着提取时间的延长，总黄酮提取率增大，当提取时间到达60 min时，总黄酮提取率达到最大，再继续增加时间，总黄酮提取率反而下降。其原因可能是提取时间太短，黄酮与蛋白质、多糖等结合物不能较好地分离，提取率较低；提取时间过长，部分黄酮结构受到破环，从而降低了提取率。故提取时间选择60 min为0水平，进行响应面法优化。
提取温度对仙鹤草黄酮提取率的影响见图2所示。
图2 提取温度对总黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of the extraction temperature on the yield of total flavonoids
由图2可见，黄酮提取率随提取温度的升高而变化显著，变化趋势为先增大后减小，当温度在80℃时提取率最大。这可能是起始升高温度有利于总黄酮的扩散、溶出，故提取率增大，而当温度过高时，黄酮会受热分解，或杂质溶解度增大等原因，以致提取率减小。故提取温度选择80℃为0水平，进行响应面法优化。
提取溶剂中乙醇浓度对仙鹤草总黄酮得率的影响结果见图3。
由图3可以看出，乙醇浓度为10%～20%时，总黄酮的得率逐渐升高；当乙醇浓度为20%～50%时，总黄酮的得率有明显的下降，可能的原因是随乙醇浓度的升高，溶液极性减弱，可溶性黄酮成分含量减少所致。故乙醇浓度选择20%为0水平，进行响应面法优化。
图3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
Fig.3 Effect of the concentration of ethanol on the yield of total flavonoids
料液比对总黄酮提取量的影响见图4。
图4 料液比对总黄酮提取率的影响
Fig.4 Effect of ratio of material to solvent on the yield of total flavonoids
由图4可知，在一定范围内，仙鹤草的黄酮提取量随料液比的增大而增大，但料液比增大到一定程度后，黄酮提取量逐渐趋于饱和。仙鹤草在料液比为1∶25（g/mL）时总黄酮提取量达到最大，故料液比选择1∶25（g/mL）为0水平，进行响应面法优化。
响应面中心组合设计方案及结果见表2。
表2 响应面中心组合设计方案及结果
Table 2 The central composite design and the results of experiments
续表2 响应面中心组合设计方案及结果
Continue table 2 The central composite design and the results of experiments
利用Design-Expert 8.0.5b软件，根据表1设定的因素和水平，选取 A（提取时间）、B（提取温度）、C（乙醇浓度）、D（料液比）4因素为自变量，黄酮提取率（Y）为响应值，试验及其结果见表2。对表2数据进行多元回归拟合和方差分析，得回归方程：Y=3.79+0.36A+0.50B+0.55C+0.033D+0.18AB+0.11AC-0.22AD+0.27BC+0.079BD-0.14CD-0.057A2+0.12B2+0.036C2-0.051D2，其中 Y 为仙鹤草黄酮提取率，A、B、C、D 分别为上述3个自变量的编码值。方差分析见表3。
由表3可得，该回归模型具有统计学意义（P＜0.000 1），具极度显著性，能够正确反映各因素与响应值之间的变化关系。确定系数R2=0.973 2，表明可用该模型解释97.32%的试验数据；调整的确定系数Radj2=0.948 1，说明该模型反映的仙鹤草黄酮提取率的变化有94.81%来自A、B、C、D 4个因素；模型的变异系数CV=5.02%，较小，说明试验稳定、可靠。
表3 仙鹤草黄酮提取回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance of the extraction of the flavonoids from Agrimonia pilosa
注：*差异显著（P＜0.05）；**差异高度显著（P＜0.01）；***差异极显著（P＜0.001）。
从表3显著性水平P可见，模型中各因素对Y值影响极显著的为A、B、C、AD、BC，高度显著的为AB、B2，显著的为 AC、CD，而 D、BD、A2、C2、D2为不显著。这反映了提取温度、提取时间、乙醇浓度及料液比4因素对仙鹤草黄酮提取率的显著影响既有线性关系也有平方关系，也存在极显著的交互作用。从F值大小可知，4因素对仙鹤草黄酮提取率影响大小次序为：乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞料液比。
对二次归模型中提取时间、提取温度、乙醇浓度和料液比4因素，分别固定2因素（取0水平值）而改变其余2因素取值，根据所得响应值，可绘出响应曲面图。因素交互作用对仙鹤草黄酮提取率影响的响应面图如图5所示。
由图5可知，并不是所有因素对仙鹤草总黄酮的提取都有显著的影响。其中，乙醇浓度和提取温度的影响最为显著，随着乙醇浓度和提取温度的增大，总黄酮得率随之增大，表现为曲面较陡；提取时间的影响次之，表现为曲面相对平缓且随其数值的增加而增大，响应值变化相对较小；料液比的影响最小，曲面最为平缓。显然，响应面图分析结论与方差分析结果一致。
利用Design Expert 8.0.5b软件分析得到回归模型，得到最佳提取工艺为：提取时间100 min、提取温度100℃、乙醇浓度 30%、料液比 1∶15.35（g/mL），此条件下仙鹤草总黄酮提取率预测值为10.05%。
图5 各因素两两交互作用对总黄酮提取率影响的响应面图
Fig.5 Response surface map of the effect of the interaction between the two test variables and the yield of total flavonoids
为检验上述理论工艺条件的可靠性，须做验证试验。为试验操作和控制方便，可将理论工艺条件修改为：提取时间100 min、提取温度100℃、乙醇浓度30%、料液比 1∶15（g/mL）。在此条件下，进行平行 3次验证试验，得到总黄酮平均得率实际值为9.92%，与理论预测值10.05%相比，相对误差为1.29%，二值非常接近，说明该回归模型能较好地模拟和预测试验结果，响应面优化法所确定的仙鹤草总黄酮提取工艺条件准确可靠。
对仙鹤草总黄酮提取工艺进行优化得到多因素二次回归方程，方差分析显示该回归方程具有高度显著性，拟合度良好，能够较好地对仙鹤草总黄酮提取工艺进行预测分析。响应面法优化得到最佳提取工艺为提取时间100 min、提取温度100℃、乙醇浓度30%、料液比1∶15（g/mL）。平行3次验证结果显示，实测值与预测值吻合度较好，模型可靠性较高，能进行较好的结果预测。
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Optimization of Extraction of the Total Flavonoids from Agrimonia pilosa Ledeb.by Response Surface Methodology
YE Chun-lin，MUNYONHO Ferris Tatenad，HUANG Pan-pan，LI Jia-jun，JING Jie，FANG Hui
（School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Zhejiang Provincial Key Lab for Chem&Bio Processing Technology of Farm Produces，Hangzhou 310023，Zhejiang，China）
Abstract：In order to optimize the extraction method of total flavonoids from Agrimonia pilosa Ledeb.，based on single factor experiments，extraction time，extraction temperature，ethanol concentration and ratio of solid to liquid were selected as influencing factors and the yield of total flavonoids as response during extraction.The experiment method was designed according to central composite design and each variable and their interactions effects on the yield of total flavonoids were studied.The quadratic multinomial model on the yield of total flavonoids and each factor was established by using the Design-Expert software.The results showed that the regression model was very significant and the forecast was strong.Ethanol concentration and extraction temperature were the main factors.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：extraction time of 100 min，extraction temperature of 100℃，ethanol concentration of 30%and ratio of solid to liquid 1∶15（g/mL）.The verification experiment，repeated three times in the best extraction conditions，showed that the average yield of flavonoids was 9.92%.
Key words：Agrimonia pilosa Ledeb.；response surface methodology；flavonoids；extraction
收稿日期：2017-01-09
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.011
基金项目：浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划（2016R415018）
作者简介：叶春林（1969—），男（汉），副教授，博士，主要从事天然产物的提取工艺及其生物活性的研究。