响应面法优化百合多糖超声辅助提取工艺

张占军1，王富花2，葛洪1，张军1，李海凤1

（1.扬州市职业大学工程研究中心，江苏扬州225009；2.扬州工业职业技术学院，江苏扬州225127）

摘 要：以宜兴百合为原料，采用超声辅助法提取百合中的多糖物质。通过单因素试验，考察不同水平的超声功率、超声温度、超声时间和液料比对百合多糖得率的影响，并在单因素试验的基础上采用响应面法优化超声辅助提取百合多糖的工艺条件。试验结果表明，百合多糖最佳提取工艺条件为：超声功率176 W，超声温度52℃、超声时间30 min和液料比15∶1（mL/g），在该条件下，百合多糖的平均得率为12.37%，与理论预测值间差异不显著，表明试验获得的回归数学模型能够准确预测百合多糖的得率。

关键词：百合；多糖；响应面法；超声；提取工艺

百合（Lily）为百合科百合属多年生草本球根植物，又名强蜀、番韭、山丹、倒仙、重迈、中庭、摩罗、重箱、夜合花等，为卫计委首批公布的药食两用植物之一[1]。百合的药用价值极高，其味甘微苦，性平，味淡，微寒，具有养阴润肺止咳、清心安神、补中益气的功效[2]。近年来的研究发现，百合中除含有氨基酸、蛋白质、淀粉、脂肪、维生素和微量元素等基本营养物质外，还含有多糖、秋水仙碱、皂苷等生物活性成分[3]。百合中多糖含量较高，最高可达30.41%[4]，其含量大小与品种、产地、采收期及提取检测方法等因素密切相关。百合多糖具有广泛药理活性，如免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抑菌等生物活性，具有较高研究价值[5]。

目前多糖的提取多采用热水浸提的方法，温度高，耗时长。近年来超声波辅助提取方法已广泛应用于多糖的提取过程，利用超声波的空化作用，可加速细胞壁的破裂，促进多糖的溶出，缩短提取时间，提高多糖提取效率。此外，响应面分析法作为一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，已成功应用于多种多糖的提取过程。本试验拟采用响应面优化法，以宜兴百合的多糖得率为响应值，通过考察超声功率、提取温度、提取时间和液料比等因素，采用Box-Behnken中心设计法，建立并验证相关的工艺数学模型，同时对提取的多糖进行初步分析，以期为药食两用植物百合的进一步开发利用提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百合：产地江苏宜兴；无水乙醇、葡萄糖、苯酚、硫酸、无水乙醚、丙酮等：国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；TDL-5000B型离心机：上海安亭科学仪器厂；SB-5200DTD超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；722可见分光光度计：上海光学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 超声波辅助提取百合多糖工艺

新鲜百合→去杂、掰片、烘干→破碎→石油醚回流脱脂→95%乙醇回流除小分子→烘干（预处理样品）→称取适量→加水超声辅助提取→离心→上清液浓缩→加乙醇至85%终浓度醇沉→离心→沉淀部分→依次用无水乙醇、丙酮、石油醚抽洗→干燥→百合粗多糖

1.3.2 多糖含量和提取率的测定

1.3.2.1 百合多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法。即利用硫酸对多糖的水解作用，生成的单糖脱水生成糠醛衍生物，后与苯酚反应生成有色化合物，在490 nm处进行比色测定[6]。

1.3.2.2 百合多糖得率的计算

百合多糖得率 Y/%=（WE× CT）/WP× 100

式中：WE为百合粗多糖的质量，g；WP为经预处理的百合质量，g；CT为百合粗多糖中总糖的含量。

1.3.3 单因素试验

通过超声辅助、热水浸提、乙醇沉淀的方法提取百合多糖。分别考察不同水平的超声功率、超声温度、超声时间和液料比对百合多糖得率的影响。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验确定的各变量范围，选取超声功率（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和液料比（D）为自变量，百合多糖得率为响应值，通过Design Expert 8.0.6软件，采用Box-Behnken试验设计方法，进行四因素三水平的响应面分析试验，同时对试验数据进行回归分析，预测超声辅助提取百合多糖的最佳提取工艺。

1.3.5 数据处理方法

所有数据均测定3次，以平均值±标准差方式表示，单因素试验通过SPSS 22.0软件进行数据处理进行差异显著性分析，P＜0.05认为具有显著差异，响应面试验采用Design Expert 8.0.6软件进行结果分析。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助提取单因素试验结果

2.1.1 超声功率对百合多糖得率的影响

超声功率对百合多糖得率的影响见图1。

图1 超声功率对百合多糖得率的影响
Fig.1 Effects of ultrasonic power on the yield of Lily polysaccharide

由图1可以看出，在100 W～160 W范围内，百合多糖提取率随着超声功率提高而增加[7]，在超声功率160 W时多糖得率达到最大值11.27%，此后再增大超声功率，百合多糖得率开始下降。这可能是由于随着超声功率的增强，超声波空化作用加剧，使得部分非多糖成分溶出，影响了百合多糖的溶出过程，同时超声功率的增大也可能对溶出多糖产生一定程度的降解，因此导致百合多糖得率下降。综合考虑，选择160 W为百合多糖超声功率中心试验点。

2.1.2 超声温度对百合多糖得率的影响

超声温度对百合多糖得率的影响见图2。

图2表明，超声过程中温度对百合多糖提取得率有较为明显的影响，在30℃～50℃范围内，温度升高，百合多糖得率增大，在超声温度为50℃时多糖得率达到最大值，此后再增大，百合多糖得率开始下降。温度升高到一定值后，水分开始蒸发，影响多糖的溶出，同时温度过高也导致了已溶出多糖的降解，从而造成百合多糖得率的降低[8]。因此选择50℃为百合多糖超声温度中心试验点。

图2 超声温度对百合多糖得率的影响
Fig.2 Effects of extraction temperature on the yield of Lily polysaccharide

2.1.3 超声时间对百合多糖得率的影响

超声时间对百合多糖得率的影响见图3。

图3 超声时间对百合多糖得率的影响
Fig.3 Effects of extraction time on the yield of Lily polysaccharide

从图3可以看出，在超声时间10 min～40 min范围内，百合多糖提取率随着超声时间延长而增加，超声时间至40 min时多糖得率达到最大值。此后再延长超声时间，多糖得率变化不显著，甚至有降低趋势。这是由于开始提取液中百合多糖浓度低，延长时间有助于多糖的溶出，但当多糖的溶出达到一定程度后，单纯延长时间很难再增加多糖的进一步溶解，甚至使多糖发生降解[9]。综合考虑，选择30 min为百合多糖提取超声时间中心试验点。

2.1.4 液料比对百合多糖得率的影响

液料比对百合多糖得率的影响见图4。

图4表明，在液料比5∶1 mL/g～20∶1 mL/g范围内，百合多糖提取率随着液料比增加而快速增加，液料比至20∶1 mL/g时多糖得率达到最大值，但当液料比15∶1 mL/g后再增加液料比，多糖得率增加不再显著。这主要是由于初始溶剂越多，多糖溶出就越多，从而多糖得率增加，但当多糖溶解达到平衡时，再增加溶剂的量，多糖的溶解受到溶剂量的影响有限[10]。考虑到后期浓缩等操作，选择15∶1 mL/g为百合多糖提取液料比中心试验点。

图4 液料比对百合多糖得率的影响
Fig.4 Effects of ratio of water to material on the yield of Lily polysaccharide

2.2 响应面法对百合多糖提取条件的优化

2.2.1 响应面试验设计与结果

根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础上，利用Design Expert软件进行四因素三水平的响应面法进行试验设计，试验方案及结果见表1。设计了29次响应面分析试验，其中24次为析因点试验，5次为零点试验，以估计误差。

表1 Box-Behnken设计模型及试验值
Table 1 Box-Behnken design matrix and experimental values

序号 A超声功率/W百合多糖得率/%1 -1（140） -1（40） 0（30） 0（15∶1） 8.54 2 1（180） -1（40） 0（30） 0（15∶1） 9.51 3 -1（140） 1（60） 0（30） 0（15∶1） 9.27 4 1（180） 1（60） 0（30） 0（15∶1） 11.15 5 0（160） 0（50） -1（20） -1（10∶1） 9.68 6 0（160） 0（50） 1（40） -1（10∶1） 11.83 7 0（160） 0（50） -1（20） 1（20∶1） 11.02 8 0（160） 0（50） 1（40） 1（20∶1） 11.27 9 -1（140） 0（50） 0（30） -1（10∶1） 9.38 10 1（180） 0（50） 0（30） -1（10∶1） 10.35 11 -1（140） 0（50） 0（30） 1（20∶1） 11.44 12 1（180） 0（50） 0（30） 1（20∶1） 11.68 13 0（160） -1（40） -1（20） 0（15∶1） 8.81 14 0（160） 1（60） -1（20） 0（15∶1） 9.82 15 0（160） -1（40） 1（40） 0（15∶1） 10.61 16 0（160） 1（60） 1（40） 0（15∶1） 11.36 17 -1（140） 0（50） -1（20） 0（15∶1） 11.02 18 1（180） 0（50） -1（20） 0（15∶1） 9.37 19 -1（140） 0（50） 1（40） 0（15∶1） 10.33 20 1（180） 0（50） 1（40） 0（15∶1） 12.20 21 0（160） -1（40） 0（30） -1（10∶1） 10.13 22 0（160） 1（60） 0（30） -1（10∶1） 9.37 23 0（160） -1（40） 0（30） 1（20∶1） 9.56 24 0（160） 1（60） 0（30） 1（20∶1） 11.09 25 0（160） 0（50） 0（30） 0（15∶1） 12.17 B超声温度/℃C超声时间/min D液料比/（mL/g）

续表1 Box-Behnken设计模型及试验值
Continue table 1 Box-Behnken design matrix and experimental values

序号 A超声功率/W百合多糖得率/%26 0（160） 0（50） 0（30） 0（15∶1） 11.46 27 0（160） 0（50） 0（30） 0（15∶1） 12.14 28 0（160） 0（50） 0（30） 0（15∶1） 12.06 29 0（160） 0（50） 0（30） 0（15∶1） 11.90 B超声温度/℃C超声时间/min D液料比/（mL/g）

2.2.2 百合多糖提取工艺回归模型的建立及方差分析

对表2中的试验数据进行回归分析，得到百合多糖得率对以上4个因素的回归方程为：

百合多糖得率=11.95+0.36A+0.41B+0.66C+0.44D+0.23AB+0.88AC-0.18AD-0.065BC+0.57BD-0.48CD-0.81A2-1.44B2-0.42C2-0.49D2

对回归模型进行方差分析，结果见表2。

表2 回归模型方差分析
Table 2 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

注：-表示不显著（P＞0.05）；*表示显著（P＜0.05）；**表示极显著（P＜ 0.01）。

方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著水平模型 32.20 14 2.30 11.36 ＜0.000 1 **A超声功率 1.53 1 1.53 7.54 0.015 8 *B超声温度 2.00 1 2.00 9.88 0.007 2 **C超声时间 5.17 1 5.17 25.56 0.000 2 **D液料比 2.36 1 2.36 11.65 0.004 2 **AB 0.21 1 0.21 1.02 0.329 1 -AC 3.10 1 3.10 15.30 0.001 6 **AD 0.13 1 0.13 0.66 0.430 8 -BC 0.02 1 0.02 0.08 0.776 9 -BD 1.31 1 1.31 6.48 0.023 4 *CD 0.90 1 0.90 4.46 0.053 2 -A24.25 1 4.25 20.98 0.000 4 **B213.39 1 13.39 66.13 ＜0.000 1 **C21.17 1 1.17 5.77 0.030 8 *D21.55 1 1.55 7.67 0.015 1 *残差 2.83 14 0.20失拟项 2.50 10 0.25 2.94 0.154 8 -纯误差 0.34 4 0.085

该模型的确定系数为R2=0.919 1，模型的调整确定系数为R2adj=0.838 2。同时从表2可以看出：模型F值为11.36，P＜0.000 1，表明模型是高度显著的，模型的失拟项P=0.154 8，表明失拟不显著，说明该模型较稳定，能较好地预测实际百合多糖提取情况。

2.2.3 响应曲面图分析优化

因素交互作用对百合多糖得率影响的响应面图见图5。

图5 超声功率（A）、超声温度（B）、超声时间（C）和液料比（D）等因素交互作用对百合多糖得率影响的响应面图
Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of ultrasonic power（A），extraction temperature（B），extraction time（C）and ratio of water to material（D）on the extraction yield of Lily polysaccharide

结合图5可以看出，当超声时间和液料比一定时，当超声功率位于160 W～170 W，超声温度在50℃～55℃范围内时，两者交互作用对百合多糖得率的影响最大（图5a）；当超声温度和液料比一定时，超声功率越大，超声时间越长，百合多糖提取率也越高，两者交互作用对百合多糖得率影响极显著，百合多糖得率的最大值位于超声功率170 W～180 W，超声时间35 min～40 min区域内（图5b）；当超声温度和超声时间一定时，超声功率和液料比之间的交互作用对百合多糖得率的影响不显著，百合多糖得率最大值区域位于两者中心试验点附近（图5c）；当超声功率和液料比一定时，百合多糖得率最大值区域位于超声温度50℃～55℃，超声时间35 min～40 min范围内，增加超声时间对百合多糖得率的影响明显大于超声温度的增加（图5d）；当超声功率和超声时间一定时，超声温度和液料比之间的交互作用对百合多糖得率的影响显著，随着超声温度的升高、液料比的增大，百合多糖得率也随之增大，最大值区域位于超声温度50℃～55℃，液料比17.5 mL/g～20 mL/g范围内（图5e）；当超声功率和超声温度一定时，超声时间和液料比之间的交互作用对百合多糖得率的影响不显著，增加超声时间对百合多糖得率的影响明显大于液料比的改变（图5f）。

2.2.4 提取参数优化及模型验证

通过 Design Expert软件可知，当 A＝0.80、B＝0.17、C＝1.00、D＝－0.08时，Y出现理论最大值12.70%。可得出百合多糖最佳提取工艺条件为超声功率176 W，超声温度 51.7℃、超声时间 30 min 和液料比 14.6∶1（mL/g）。考虑到实际操作的便利性，百合多糖最佳提取工艺条件最终确定为超声功率176 W，超声温度52℃、超声时间30 min和液料比15∶1（mL/g）。通过5次验证性试验，验证了该模型方程的适用性，验证性试验中百合多糖的得率为（12.37±0.23）%，而回归方程所得的理论预测值为12.71%，通过IBM SPSS Statistics 22软件，进行单样本T检验，表明P值=0.075＞0.05，因此可以认为采用优化工艺条件所得实验值与理论预测值间没有差异，即该方程能较好的预测百合多糖的提取得率。

3 结论

本研究以宜兴百合为原料，通过单因素及响应面试验，优化了超声辅助提取百合多糖的工艺，基于Design Expert软件得到百合多糖最佳提取工艺为：超声功率176 W，超声温度52℃、超声时间30 min和液料比15∶1mL/g。在此条件下，百合多糖的得率为12.37%，与传统的热水浸提法相比，该提取方法具有温度低、时间短、提取效率高等优点，可为百合多糖的高效提取提供一定的参考。

参考文献：

[1] 刘木清,秦龙,伍春.百合繁殖技术[J].花木盆景:花卉园艺,2016(2):29-31

[2] 胥京宜.百合的开发与利用[J].湖北农业科学,1999(4):44

[3] You X,Xie C,Liu K,et al.Isolation of non-starch polysaccharides from bulb of tiger lily(Liliumlancifolium Thunb.)with fermentation of Saccharomyces cerevisiae[J].Carbohydrate Polymers,2010,81(1):35-40

[4] 孙俊,张科卫,秦昆明,等.不同产地百合多糖的含量测定[J].南京中医药大学学报,2010,26(1):65-66

[5] Chen Z G,Zhang D N,Zhu Q,et al.Purification,preliminary characterization and in vitro immunomodulatory activity of tiger lily polysaccharide[J].Carbohydrate Polymers,2014,106(1):217-222

[6] 冯程程,王思明.桂花多糖的提取及含量测定方法研究[J].科技资讯,2013(3):87

[7] Zheng Y,Li Y,Wang W D.Optimization of ultrasonic-assisted extraction and in vitro antioxidant activities of polysaccharides from Trametes orientalis[J].Carbohydrate Polymers,2014,111:315-323

[8] Liu Y,Qiang M,Sun Z,et al.Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from Hovenia dulcis peduncles and their antioxidant potential[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,80:350-357

[9] Aun Raza,Feng Li,Xiuquan Xu,et al.Optimization of ultrasonicassisted extraction of antioxidant polysaccharides from the stem of Trapaquadrispinosa using response surface methodology[J].International Journal of Biological Macromolecules,2017,94:335-344

[10]Afshari K,Samavati V,Shahidi S A.Ultrasonic-assisted extraction and in-vitro antioxidant activity of polysaccharide from Hibiscus leaf[J].International Journal of Biological Macromolecules,2015,74:558-567

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Lily Polysaccharide by Response Surface Methodology

ZHANG Zhan-jun1，WANG Fu-hua2，GE Hong1，ZHANG Jun1，LI Hai-feng1
（1.Engineering Research Center，Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China；2.Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

Abstract：The polysaccharide from Lily was extracted by ultrasonic-assisted extraction （UAE）method using flesh Lily in Yixing as raw materials.Firstly，the effects of the four main factors（ ultrasonic power，ultrasonic temperature，ultrasonic time and ratio of water to material）on the yield of Lily polysaccharide was discussed through single-factor experiments.The extraction technological condition of Lily polysaccharide was optimized with response surface method after single－factor test.Results showed that the maximum extraction yield of Lily polysaccharide was obtained at ultrasonic power 176 W，extraction temperature 52℃，extraction time 30 min and ratio of water to material 15 ∶1（mL/g）.Under this condition，the yield of Lily polysaccharide with ultrasonic extraction was the best of 12.37%，and the difference was not significant compared with the theoretical prediction.The mathematical model obtained in this experiment could accurately predict the yield of polysaccharide from Lily.This results will provide an experimental basis to further develop the resources of Lily in Yixing.

Key words：Lily；polysaccharide；response surface methodology；ultrasonic；extraction process

收稿日期：2017-01-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.009

基金项目：江苏省基础研究计划（自然科学基金）项目（BK20141269）；江苏省高校“青蓝工程”中青年学术带头人资助[苏教师[2016]15号]；江苏省第五期“333高层次人才培养工程”

作者简介：张占军（1977—），男（汉），副教授，博士，研究方向：食品生物技术。