图1 簕菜叶不同萃取层提取物的提取过程
Fig.1 The extraction process of different extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves
程书朋1，张焜1，2，武文敬1，胡浩鹏1，林惠琼1，梁立尹1，李冬利2，何燕1，*
（1.广东工业大学轻工化工学院，广东广州510006；2.五邑大学化学与环境学院，广东江门529020）
摘 要：研究簕菜叶提取物中总黄酮含量及其抑菌活性，为簕菜的开发利用提供科学依据。首先，以95%乙醇回流提取簕菜叶粉末，依次用不同有机溶剂萃取得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取萃取层和剩余水层；然后采用标准曲线法分别测定簕菜叶各萃取层总黄酮含量；采用最低抑制浓度法考察各萃取层对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等8种试验菌的抑制效果。结果表明，乙酸乙酯层总黄酮含量最高，为282.39 mg/g。石油醚层抑菌效果最佳，石油醚层对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、藤黄微球菌均具有较强的抑制效果，其最低抑制浓度（MIC）为10 μg/mL～40 μg/mL，对芽孢杆菌的抑制作用稍差。抑菌活性与总黄酮含量之间存在一定的相关性，但二者并非简单的正比关系。
关键词：簕菜；总黄酮；含量；抑菌活性
簕菜，学名白簕（Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr.）又称苦刺、三加皮、三叶五加、鹅掌簕等，为五加科（Araliaceae）五加属（Acanthopanax）的攀援灌木，多生于林缘、灌丛或山坡[1]。作为药食两用植物，簕菜除良好的营养保健价值外，还含有较多的黄酮类、多酚类及挥发油等活性物质[2-4]。其中黄酮类化合物对自然界中的很多病原微生物具有广泛的抑制和杀灭作用[5]。相关研究报道了植物黄酮及多酚类物质的抑菌活性，其药理活性在药物及功能食品方面具有明显的优势，并从中发现和提取低毒广谱抗菌的黄酮类物质，对药物及功能食品的发展起到了重要作用[6-8]。
目前，鲜见系统的簕菜抑菌活性研究报道。本文以乙醇回流提取簕菜叶粉末得到粗提物，以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇以及水依次萃取簕菜叶乙醇粗提物得到不同萃取层，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌、白葡萄球菌8种细菌为供试菌株，采用最低抑制浓度法考察不同萃取层萃取物的抑菌效果，并测定不同萃取层的总黄酮含量，建立总黄酮与抑菌活性之间的联系，为簕菜的进一步开发利用提供理论依据。
簕菜：广东省恩平市雪荘茶厂。
营养琼脂培养基：广州瑞舒试剂有限公司；LB液体培养基、环丙沙星：Sigma-Aldrich；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）、沙门氏菌（Salmonella）、枯草芽孢杆菌（B.cereus）、绿脓杆菌（P.Aeruginosa）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、蜡状芽孢杆菌（B.subtilis）、白葡萄球菌（White staphylococcus）：皆采购于广州微生物研究所。
CS-400A型粉碎机：辰禾盛丰工贸有限公司；SN510C型立式压力蒸汽灭菌器：重庆雅马拓科技有限公司；DHP-9162型电热恒温培养箱、DZF-6090型真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；SHZ-82型气浴恒温振荡器：金坛市科析仪器有限公司；SW-OJ-2FD型洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；RE-2000A型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；ML204型电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司。
新鲜簕菜叶在80℃干燥24 h，后用粉碎机粉碎并过100目筛，105℃下干燥4 h，得簕菜叶粉。准确称取20 g粉末置于500 mL圆底烧瓶中，加入一定量的95%无水乙醇溶液80℃下回流提取2 h，过滤后继续回流提取，以上提取过程共进行3次。将所得提取物旋转蒸发浓缩并真空干燥至恒重，称重。
准确称取10 g簕菜叶乙醇提取物，溶于20 mL乙醇，倒入100 mL分液漏斗中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取，得到不同极性的萃取物。
石油醚层（A）：加入50 mL石油醚，振荡摇匀，静置分层，取上层石油醚部分，继续萃取2次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩，得黄褐色膏状黏稠物，真空干燥至恒重，称重并计算得率。下层溶液收集备用。
氯仿层（B）：将石油醚萃取后的下层溶液加入50 mL氯仿，振荡摇匀，静置分层，取下层氯仿部分，继续萃取2次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩，得黄褐色膏状黏稠物，真空干燥至恒重，称重并计算得率。上层溶液收集备用。
乙酸乙酯层（C）：将氯仿萃取后的上层溶液加入50 mL乙酸乙酯，振荡摇匀，静置分层，取上层乙酸乙酯部分，继续萃取2次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩，得黄色膏状黏稠物，真空干燥至恒重，称重并计算得率。下层溶液收集备用。
正丁醇层（D）：将乙酸乙酯萃取后的下层溶液加入50 mL正丁醇，振荡摇匀，静置分层，取上层正丁醇部分，继续萃取2次，合并萃取液，旋转蒸发浓缩，得淡黄色膏状黏稠物，真空干燥至恒重，称重并计算得率。下层溶液收集备用。
水层（E）：将正丁醇萃取后的下层溶液减压浓缩，得到淡黄色膏状黏稠物，真空干燥至恒重，称重并计算得率。
提取过程如图1所示。准确称取上述5种不同部位萃取物，分别用二甲基亚砜溶解，配制成2.56 mg/mL的各萃取物溶液，保存备用。
图1 簕菜叶不同萃取层提取物的提取过程
Fig.1 The extraction process of different extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves
以芦丁为对照品，采用标准曲线法计算样品中总黄酮的含量[9-10]。
标准曲线的制备：精密量取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于 7 个 10 mL 具塞试管中，用30%乙醇补充至5 mL，再加入0.3 mL质量分数为5%的NaNO2溶液，混匀，放置5 min后分别加入0.3 mL，质量分数为10%的Al（NO）3溶液，混匀，放置6 min，加的4 mL的1 mol/L的NaOH混匀，用30%乙醇定容至10 mL，摇匀，以无水乙醇作空白，用紫外-可见分光光度法在510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），芦丁浓度为横坐标（mg/mL），绘制标准曲线。
样品测定：精密量取待测提取物溶液1.0 mL（V0），用30%乙醇补充至5 mL，再加入0.3 mL质量分数为5%的NaNO2溶液，混匀，放置5 min后分别加入0.3 mL，质量分数为10%的Al（NO）3溶液，混匀，放置6 min，加的4 mL的1 mol/L的NaOH混匀，用30%乙醇定容至10 mL，摇匀，以无水乙醇作空白，用紫外-可见分光光度法在510 nm处测定吸光度，由标准曲线计算出供试品溶液中含总黄酮的浓度（c），从而计算样品中总黄酮的含量（X）。
式中：X为试样中总黄酮量（以芦丁计），mg芦丁/g簕菜叶粉末；c为经试样自身校正后，由标准曲线算得被测液中总黄酮浓度，mg/mL；V为试样定容后体积，mL；m为供试溶液制备中称取试样的质量，g；n为试样测定稀释的倍数；V0为试样测定的取样量，mL。
计算结果保留4位有效数字。
将供试菌种接入相对应的试管斜面培养基上，于37℃恒温培养箱内培养24 h，培养完成后，置于4℃冰箱中冷藏备用。将配置好的LB液体培养基于121℃灭菌20 min，室温冷却后，用接种环从斜面培养基上挑取一环置于10 mL灭菌液体培养基中，于37℃摇床中培养24 h，活化2次。用接种环挑取少许活化的菌种以无菌水稀释至0.5麦氏比浊液菌悬液，分别制成1.5×108CFU/mL的菌悬液，再用LB液体培养基稀释100倍，配制成1.5×106CFU/mL的菌悬液，备用[11-12]。
采用液体稀释法测定，每种菌的测定，需取30支试管，分5组，将每组6支试管编号。将LB液体培养基和试管于121℃灭菌20 min，冷却后，试管中各加入1 mL液体培养基，5组的第一支试管中各对应加入1 mL石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层萃取物，按照两倍稀释法，将提取物配成不同的浓度，每组试管中各加入该试验菌0.1 mL，摇匀。将试管置于37℃恒温培养箱中培养24 h，观察细菌生长情况。其他7种菌同样操作[11]。
根据簕菜叶各部位萃取物的重量计算得到不同萃取层提取物的提取率，如表1所示。
表1 簕菜叶不同萃取层提取物的提取率
Table 1 The extraction rate of different extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves
从表1可以看出，氯仿层提取率最高，为48.94%，其次为石油醚层，为22.25%。5个萃取层提取物的提取率由高到低依次为：氯仿层＞石油醚层＞水层＞正丁醇层＞乙酸乙酯层。
采用标准曲线法测定簕菜各萃取层中总黄酮的含量结果显示如图2。
图2 簕菜叶各萃取部位的总黄酮含量比较
Fig.2 Contents of total flavonoid of the extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves
由图2可知，不同提取物的总黄酮含量不同。其中，乙酸乙酯层提取物的总黄酮含量最高，达到282.39mg/g，其次为石油醚层提取物，为141.13 mg/g，水层提取物含量最低，仅为25.81 mg/g，表明簕菜提取物中总黄酮主要集中于乙酸乙酯层。
簕菜叶乙醇提取物的石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层、水层5个萃取物的抑菌效果见表2。
表2 簕菜叶不同萃取层提取物对8种细菌的最低抑菌浓度
Table 2 MIC of different extraction layer of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr extracts for eight kinds of bacteria
由表2可以看出，正丁醇层与水层萃取物对8种细菌的抑制作用不明显，乙酸乙酯层萃取物对沙门氏菌与大肠杆菌有微弱的抑制作用。5个萃取物的抑菌效果由强到弱依次为：石油醚层＞氯仿层＞乙酸乙酯层＞正丁醇层＞水层。石油醚层萃取物对8种细菌都有较好的抑制作用，对沙门氏菌的抑制作用最强，最为接近环丙沙星的抑菌效果。氯仿层萃取物对沙门氏菌与大肠杆菌的抑制作用稍逊于石油醚层萃取物。
采用乙醇提取簕菜叶中有效成分，研究醇提取物不同萃取部位的总黄酮含量及其抑菌活性。试验结果显示簕菜各萃取部位都含有总黄酮，5个萃取层萃取物总黄酮含量由高到低依次为：乙酸乙酯层＞石油醚层＞正丁醇层＞氯仿层＞水层，其中乙酸乙酯层总黄酮含量最高，为282.39 mg/g，其次为石油醚层萃取物，为141.13 mg/g。因此，簕菜不论是作为野生保健蔬菜还是药用植物，都具有较高的经济价值和广泛的开发前景。
抑菌试验结果表明石油醚层提取物、氯仿层提取物以及乙酸乙酯层提取物对沙门氏菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌等8种细菌均存在一定的抑制作用，而水层提取物与正丁醇层提取物对8种试验菌均无明显抑制作用。通过对各提取物的抑菌活性比较，发现石油醚层提取物对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌8种细菌的MIC分别为10、20、40、40、40、80、80、80 μg/mL，其抑菌作用最强，可作为植物资源的抑菌剂并进一步研究。
根据研究报道植物黄酮具有良好的抑菌活性，结合簕菜叶各萃取层的抑菌活性及其总黄酮含量分析，发现二者存在一定的相关性。各萃取层中都含有总黄酮，总黄酮含量为20 mg/g～150 mg/g，也都具有一定的抑菌活性，其中石油醚层总黄酮含量较高，其抑菌活性最佳。但是抑菌活性与总黄酮含量并不成简单的正比关系。在进行植物抑菌活性研究时，应认识到其成分的复杂性和各种成分性质的差异性，多种成分同时存在时可能仅存在“最低抑菌浓度”。
综上，对簕菜叶醇提物乙酸乙酯层和石油醚层提取物的化学成分做深入研究，有望寻找到新型的抑菌剂。
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Research of Total Flavonoid Content and Antibacterial Activity of the Extracts of Acanthopanax trifoliatus（L.）Merr Leaves
CHENG Shu-peng1，ZHANG Kun1，2，WU Wen-jing1，HU Hao-peng1，LIN Hui-qiong1，LIANG Li-yin1，LI Dong-li2，HE Yan1，*
（1.School of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.School of Chemical and Environmental，Wuyi University，Jiangmen 529020，Guangdong，China）
Abstract：Total flavonoid contents and antibacterial activities of the extracts ofAcanthopanax trifoliatus（L.）Merr leaves were investigated.The powder of leaves were extracted with 95%EtOH.After the solvent were evaporated，the resultant extract was then extracted in turn with petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，n-BuOH and water.The contents of total flavonoid of the extracts were measured by the standard curve method.The antibacterial activities of the extracts were measured by using minimum inhibiting concentration method against eight bacteria，such asE.coli，Salmonella，S.aureus.The result indicated that the highest content of flavonoid was 282.39 mg/g in the ethyl acetate extract.The petroleum ether extract had the best antibacterial activity.The extract from petroleum ether exhibited higher inhibition effect toSalmonella，E.coli，S.aureus，White staphylococcusandMicrococcus luteuswith a MIC range of 10 μg/mL to 40 μg/mL and lower inhibition effect to bacillus.The correlation bettween the content of total flavonoid and antibacterial activity was existed but not a simple proportional relationship.
Key words：Acanthopanax trifoliatus；total flavonoid；content；antibacterial activity
收稿日期：2017-01-04
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.008
基金项目：广东省自然科学基金面上项目（2016A030313006）；江门市农业科技攻关计划项目（20150160008298）
作者简介：程书朋（1991—），女（汉），硕士，研究方向：化学工程与技术。
*通信作者：何燕（1979—），女，高级工程师，博士，研究方向：药物制剂。