张倩1，2，刘睿1，2，3，程建明1，2，3，王欣之1，2，3，杜俊潮1，2，张文英1，2，吴皓1，2，3，*
（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏南京210023；3.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏南京210023）
摘 要：采用大孔吸附树脂与阳离子交换树脂串联纯化四角蛤蜊醇沉上清液中核苷类成分，以核苷的纯度和回收率为指标，考察树脂的型号、上样浓度、水洗体积、洗脱剂浓度及流速对纯化效果的影响，以期得到最佳的纯化工艺。确定大孔吸附树脂的型号及最佳工艺为：SP207型，质量浓度250 mg/mL，pH值为5.0，水洗除杂体积是3 BV，洗脱液为体积分数5%乙醇。进一步通过离子交换树脂纯化，确定树脂型号及最佳纯化工艺为：001*7阳离子交换树脂，质量浓度6.3 mg/mL，氨水∶乙醇（体积比3∶30）溶液洗脱，洗脱流速是3 BV/h。经两种树脂串联纯化后，四角蛤蜊醇沉上清液中核苷类成分的质量分数由1.80%提高至50.60%，总回收率为70.32%。工艺验证结果表明SP207大孔吸附树脂与001*7阳离子交换树脂串联纯化核苷类成分的方法稳定可行，能够用于四角蛤蜊核苷类成分的分离纯化。
关键词：四角蛤蜊；核苷；大孔吸附树脂；阳离子交换树脂；纯化
四角蛤蜊（Mactra veneriformis）生长于滩涂潮间带，为江苏沿海重要经济贝类之一[1]。四角蛤蜊属软体动物门（Mollusca），瓣鳃纲（Lamellibranchia），真瓣鳃目（Eulamellibranchia），蛤蜊科（Mactridae），始载于《本草经集注》，味甘、咸，性寒，具有滋阴利水，化痰软坚等功效。前期研究将四角蛤蜊软体经水提醇沉，得到上清液和沉淀两部分，其中沉淀部位主要含有粗多糖，具有较好的免疫调节及辅助降血糖的功效[2]，已开发相关功能食品；上清液部位含有氨基酸、寡肽、核苷等成分，具有保肝与抗氧化功能[3-4]。前期研究表明四角蛤蜊中富含次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷等多种核苷类成分[5]，现代研究表明核苷具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、基因治疗[6-7]等多种生物活性。基于沿海低值贝类全值化综合利用的思路，提升低值贝类的附加值，本试验对四角蛤蜊上清液中的核苷类物质进行富集与纯化。
四角蛤蜊：江苏省海洋水产研究所，批号为20150714，经江苏省海洋水产研究所万夕和研究员鉴定为蛤蜊科动物四角蛤蜊Mactra veneriformisReeve。
次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2-脱氧尿苷、肌苷、鸟苷、2-脱氧肌苷、2-脱氧鸟苷（纯度均大于99%）：美国 Sigma公司，；SK1B、PK228、JK008、D113、D001、001×16、001×7 型阳离子树脂：河北沧州宝恩树脂有限公司；SP207、AB-8、HPD100、HPD250、HPD400、HPD500大孔吸附树脂：北京绿百草科技发展有限公司；甲醇（色谱纯）：德国默克公司；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。
Waters 2695高效液相色谱仪、Waters 2489 UV检测器：美国Waters公司；3-16pk高速离心机：美国sig ma公司；R-210旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；UNIQUE-s15超纯水机：美国Millipore公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；BT-125D型电子分析天平：德国Satrourius公司；THZ-82水浴恒温振荡器：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。
取四角蛤蜊吐沙，去壳，得新鲜软体，称重，加入3倍量水煎煮，每次45 min，煎煮2次，将滤液浓缩至原软体质量的1/3，10 000 r/min离心10 min，去沉淀，得上清液，加乙醇调节体积分数至80%，静置过夜，抽滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，得水提醇沉上清液，备用。
本试验采用HPLC同时测定9种核苷类成分的含量[8]，方法如下：色谱柱：Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流动相：甲醇（A）-0.1%乙酸水（B），梯度洗脱：0～8 min，0～2%A；8 min～30 min，2%～6%A；30 min～40 min，6%～10%A；40 min～50 min，10%～30%A；流速：0.5 mL/min；检测波长：254 nm，进样体积：10 μL。通过测定四角蛤蜊醇沉上清中核苷类成分，总含量为1.8%，为9种核苷类成分（次黄嘌呤、黄嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、2-脱氧尿苷、肌苷、鸟苷、2-脱氧肌苷、2-脱氧鸟苷）。
大孔树脂与离子交换树脂常用于物质的分离纯化[9-10]。且大孔树脂与阳离子交换树脂具有选择性好、稳定性高、使用周期长等优点，本文分别考察了大孔树脂与阳离子树脂这两种不同的分离介质，收集洗脱部位并测定核苷类成分的转移率和纯度。
分别量取SP207、AB-8树脂各25 mL，用乙醇进行预处理，上样水提醇沉上清液，用2 BV水进行除杂，再用10 BV 10%乙醇洗脱，收集洗脱部位，测定核苷类成分；分别量取PK228、SK1B树脂各25 mL，用4%盐酸与4%氢氧化钠溶液进行预处理，上样水提醇沉上清液，用2 BV水进行除杂，再用10 BV 5%氨水溶液洗脱，收集洗脱部位，测定核苷类成分。
准确称取已预处理的树脂各5 g（湿重），加入样品液50 mL，置于摇床上室温振荡吸附24 h后，吸取上清液，测定核苷含量，计算吸附率。将以上饱和吸附的树脂过滤，再加入适量洗脱剂，摇匀，置于摇床上室温振摇解吸24 h，测定解吸液中核苷的含量，计算解吸率。
式中：Q为饱和吸附量，mg/g；A为吸附率，%；D为解吸率，%；C0为起始质量浓度，mg/mL；C1为平衡质量浓度，mg/mL；C2为解吸后核苷质量浓度，mg/mL；V为溶液体积，mL；M为树脂重量，g。
式中：Cr为洗脱液中核苷的质量浓度，mg/mL；C0为上样液中核苷的质量浓度，mg/mL；Vr为洗脱液体积，mL；V0为上样液体积，mL；mr为洗脱液总固含，mg；m0为上样液总固含，mg。
大孔树脂与阳离子树脂的分离效果比较见表1。
表1 大孔树脂与阳离子树脂的分离效果比较
Table 1 Comparison of separation effects of macroporous resin and cation exchange resin
表1显示，从核苷类成分的纯度考察，发现SP207大孔树脂的纯度最高，达到了16.13%，其次是SK1B阳离子交换树脂，为10.01%；从回收率考察，SP207大孔树脂的回收率明显优于其他树脂，其次仍是SK1B离子交换树脂。故在第一步纯化过程中先采用大孔吸附树脂，后续采用阳离子交换树脂，两者进行串联纯化四角蛤蜊醇沉上清中核苷类成分。
不同型号大孔树脂对核苷类成分的静态吸附及解吸情况见表2。
表2 不同型号大孔树脂对核苷类成分的静态吸附及解吸情况
Table 2 Static adsorption and desorption of nucleosides in different types of macroporous resins
筛选了6种大孔树脂，分别是SP207、AB-8、HPD100、HPD250、HPD400、HPD500型。其中 SP207 树脂的吸附率为66.67%，解吸附能力达到87.95%，均明显优于其他大孔树脂，故选择SP207型大孔吸附树脂为纯化四角蛤蜊中核苷类成分的树脂。
分别加入质量浓度为 50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 mg/mL四角蛤蜊醇沉上清液通过大孔树脂，测定吸附后的溶液中核苷类成分浓度，计算吸附率，考察不同的上样浓度对SP207型大孔树脂吸附效果的影响。上样浓度对吸附效果的影响见图1。
图1 上样浓度对吸附效果的影响
Fig.1 Effect of sample concentration on adsorption
大孔吸附树脂具有较好的吸附效果，以色散力为主的范德华力吸附极性物质。在一定范围内，上样浓度的增大有利于树脂对极性成分的吸附[11]，充分利用单位体积内的树脂。如图1所示，在SP207型大孔树脂吸附过程中，随上样浓度上升，吸附率不断增大。当浓度为250 mg/mL时，吸附效果最佳，故在上样液澄清的前提下，选择较高的质量浓度250 mg/mL进行上样。
经测定，四角蛤蜊醇沉上清液的pH值为5.0。上样液中pH值是影响树脂吸附效果的因素之一，一般可通过改变pH值，改变物质在溶液中存在的状态，从而改善树脂的吸附率。分别用盐酸和氢氧化钠调节上样液 pH 值为 3.0、4.0、6.0、7.0、8.0、9.0，以相同流速通过层析柱，测定吸附后溶液中核苷的浓度，计算吸附率。上样pH值对吸附效果的影响见图2。
图2 上样pH值对吸附效果的影响
Fig.2 Effect of sample pH on adsorption
图2考察了从酸性到碱性的区间，不同上样pH值对SP207树脂吸附效果的影响。整体而言，上样pH值为酸性时，树脂的吸附效果明显优于碱性条件。在SP207树脂吸附过程中，pH 5.0吸附效果最佳，也就是醇沉上清原本的pH值，故不调节上样pH值，直接以“2.1”项下制备的醇沉上清液进行上样。
四角蛤蜊醇沉上清液中除了核苷类成分，还含有氨基酸、寡糖、寡肽及少量盐分[5]。在大孔树脂的纯化过程中，需用少量水洗去杂质。上样液经树脂吸附后，用不同柱体积的水（2、3、4、5、6 BV）进行洗脱以除去水溶性的杂质。通过考察最佳水洗量去除杂质的影响，并达到减少目标成分损失的效果。水洗量对洗脱效果的影响见图3。
图3 水洗量对洗脱效果的影响
Fig.3 Effect of water washing amount on elution result
如图3所示，随着水洗倍数的增加，除杂率呈缓慢上升的趋势，而回收率呈下降趋势。表明少量的水可除去水溶性的杂质，而水洗体积过多则会导致核苷类成分的损失，故综合考虑水洗量为3 BV，此时除杂效果与回收率均较好。
核苷类成分极性较大，易溶于稀醇、弱碱水等。用体积分数为0%、5%、10%、20%乙醇作为解吸溶剂进行动态洗脱，收集洗脱液，HPLC测定核苷浓度，计算回收率及纯度。乙醇体积分数对洗脱效果的影响见图4。
图4 乙醇体积分数对洗脱效果的影响
Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on elution efficiency
如图4所示，低浓度的醇能达到较好的解吸效果，随着乙醇浓度的增大，核苷类成分的纯度和回收率均呈先上升后稳定的趋势。试验表明体积分数5%乙醇洗脱效果最佳，核苷纯度为33.32%，回收率为85.50%。综合考虑工业生产成本，优先选择体积分数5%乙醇作为大孔吸附树脂的洗脱剂。
将上述大孔吸附树脂的洗脱部位进行适量浓缩，继 续 分 别 上 样 JK008、D113、D001、001*16、001*7、SK1B型阳离子交换树脂，准确称取已预处理的树脂各5 g（湿重），加入样品液50 mL，置于摇床上室温振荡吸附24 h后，过滤，再加入适量洗脱剂，置于摇床上室温振摇解吸24 h，测定其吸附率与解吸附率。如表3所示。
表3 不同型号阳离子树脂对核苷类成分的静态吸附及解吸情况
Table 3 Static adsorption and desorption of nucleosides in different types of cation exchange resins
结果表明强酸性的阳离子交换树脂的吸附效果明显优于弱酸性树脂。其中001*7树脂的吸附率、解吸率均最高。故选择001*7阳离子交换树脂与大孔吸附树脂进行串联分离纯化贝类中核苷类成分。
四角蛤蜊醇沉上清经过大孔树脂纯化后，其洗脱部位进行适量浓缩，制备质量浓度为3.2、6.3、17.1、25.2 mg/mL，分别通过阳离子树脂，考察吸附率变化。上样质量浓度对吸附效果的影响见图5。
图5 上样质量浓度对吸附效果的影响
Fig.5 Effect of mass concentration of sample on adsorption
如图5所示，在001*7离子交换树脂吸附过程中，随上样浓度增加，吸附效果呈先上升后下降的趋势。当浓度为6.3 mg/mL，阳离子交换树脂对核苷类成分的吸附效果最佳。故第二步001*7离子交换树脂纯化过程中，选择适宜的上样质量浓度为6.3 mg/mL。
洗脱流速是影响洗脱效果的因素之一。分别以1、2、3、4 BV/h的流速进行洗脱，收集洗脱液，测定核苷的浓度，计算回收率及纯度，考察不同洗脱流速对001*7阳离子树脂洗脱效果的影响。洗脱流速对洗脱效果的影响见图6。
图6 洗脱流速对洗脱效果的影响
Fig.6 Effect of elution velocity on elution result
一般情况下，洗脱溶剂在树脂柱层析中流速越快，溶剂与树脂吸附交换的时间越少，越少的成分被置换出来，则洗脱回收率降低。由图6可知，洗脱流速越快，核苷类成分的回收率越低。结果表明当流速为3 BV/h时有较好的洗脱效果，且生产效率较高。故选择此流速为最佳流速。
核苷类成分属于极性大的成分，在低浓度的乙醇及碱性溶剂中溶解度较好。本试验用不同浓度的乙醇和氨水溶液作为001*7阳离子树脂的解吸溶剂，考察洗脱浓度对树脂的解吸效果。
首先，在001*7阳离子树脂中选择氨水与乙醇作为洗脱剂，比较洗脱效果，发现氨水与乙醇两者混合时，洗脱效果最佳。故进一步对洗脱剂的浓度进行考察，结果见图7A、图7B。当氨水∶乙醇（体积比为3∶30）时，核苷类成分的回收率最大，核苷含量最高，故在此条件下富集纯化效果最佳。
取四角蛤蜊软体制备醇沉上清液，分别经过大孔吸附树脂和阳离子交换树脂的分离纯化，得到总核苷类部位。将核苷对照品与纯化后部位分别注入高效液相色谱系统进行分析，结果见图8。
图7 氨水与乙醇洗脱浓度对洗脱效果的影响
Fig.7 Effect of elution concentration of ammonia and ethanol on the elution
A.氨水体积分数对洗脱效果的影响；B.氨水与乙醇混合溶液对洗脱效果的影响。
试验采用大孔树脂与阳离子交换树脂串联来纯化四角蛤蜊醇沉上清中核苷类成分。通过动态吸附、解吸实验确定最佳工艺条件：第一步纯化树脂型号为SP207型大孔树脂，质量浓度为250.0 mg/mL，pH值为5.0，体积分数为5%乙醇的洗脱剂，此时核苷质量分数为33.32%，回收率为85.50%。第二步纯化的树脂型号为001*7阳离子树脂，此时质量浓度6.3 mg/mL，流速3 BV/h，洗脱剂是氨水∶乙醇∶水（体积比3∶30∶67）溶液。经过两次树脂纯化后质量分数高达50%，提高了26倍多，且总回收率为70.32%。
目前，对于富集贝类中核苷类成分的文献报道较少。本试验将大孔吸附树脂与阳离子交换树脂进行串联，纯化四角蛤蜊中核苷类成分。核苷类成分极性较大，含有较多的共轭双键，在大孔吸附树脂的筛选中，结果表明SP207型弱极性的大孔吸附树脂对核苷类成分吸附效果明显优于极性树脂，推测其吸附力主要是色散力与分子筛作用；在阳离子交换树脂的吸附过程中，核苷类成分通过酸性离子键的作用进行吸附。
前期对四角蛤蜊醇沉上清中核苷类成分进行了鉴别，发现其中次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷等嘌呤类的物质较多[8]，这与四角蛤蜊作为海鲜贝类，其生长环境及摄食藻类有关。HPLC图结果对比显示，次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷等碱基与核苷类成分经过两次树脂串联纯化后，其回收率均较高，而其他核苷类成分回收率低，推断其可能原因是在树脂上吸附过强，洗脱不完全或在水洗除杂的过程中损失。采用HPLC共检测9种核苷类成分：次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷、鸟苷、胸腺嘧啶、2-脱氧肌苷、2-脱氧鸟苷。在试验中发现该纯化部位还含有核苷酸类成分，如腺苷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）等。
图8 核苷类成分混合标准品HPLC图（A）及未纯化（B）、纯化HPLC图（C）
Fig.8 HPLC chromatograms of Mixed standards（A）and unpurified（B），purification（C）
通过工艺放大验证，结果表明本试验的纯化方法较好地富集了四角蛤蜊醇沉上清中核苷及核苷酸类成分，且该工艺可操作性强，生产周期短，成本低，环保性强，制备纯度较高天然核苷类成分，为后续进一步开发贝类核苷类成分提供了理论基础。
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Purification of Nucleosides and Nucleobases from Mactra veneriformis
ZHANG Qian1，2，LIU Rui1，2，3，CHENG Jian-ming1，2，3，WANG Xin-zhi1，2，3，DU Jun-chao1，2，ZHANG Wen-ying1，2，WU Hao1，2，3，*
（1.College of Pharmacology，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，Jiangsu，China；2.Jiangsu Key Laboratory of Research and Development in Marine Bio-resource Pharmaceutics，Nanjing 210023，Jiangsu，China；3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine，Nanjing 210023，Jiangsu，China）
Abstract：The nucleosides were purified by macroporous adsorption resin and cation exchange resin from Mactra veneriformis，the purity and recovery rate of nucleosides were determined.The influence of the resin model，sample concentration，washing volume，concentration and flow rate on the purification efficiency were investigated in order to obtain the best purification process.The type and optimum process of macroporous resin was SP207，sample concentration was 250 mg/mL，pH value was 5.0，removal of impurities with water was 3 BV，and the eluent was the ethanol of 5%volume fraction.While the further purification of ion exchange resin determined that the resin type and the best purification process was to use 001*7 cation exchange resin，sample concentration was 6.3 mg/mL，elution solution was prepared with ammonia，ethanol and water（the volume ratio was 3∶30），elution flow rate was 3 BV/h.After tandem and purification of the two resins，the nucleosides in the alcohol precipitation supernatant of mactra quadrangularis were increased from 1.80%to 50.6%，with a total recovery of 70.32%.The process validation showed that the way to use SP207 macroporous resin and 001*7 cation exchange resin to purify nucleosides was stable and feasible，which could be adopted in the separation and purification of nucleosides in Mactra veneriformis.
Key words：Mactra veneriformis；nucleosides；macroporous resin；cation exchange resin；purification
收稿日期：2016-12-15
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.007
基金项目：国家公益性行业专项基金（201305007、201405017）；国家高技术研究发展计划（863计划）；江苏省高校优势学科建设工程项目（PAPD）；江苏省青蓝工程（2016）
作者简介：张倩（1992—），女（汉），硕士研究生，研究方向：海洋药物研究。
*通信作者：吴皓（1957—），女，教授，研究方向：海洋药物及中药炮制学研究。