黄文秀，李成辉，王吉龙，唐明礼，赵菲，陈鹏
（山东禹王生态食业有限公司，山东禹城251200）
摘 要：利用中性蛋白酶水解大豆分离蛋白（SPI），并通过荧光探针法、SGS-PAGE凝胶电泳及扫描电镜技术对不同水解度（DH）下的SPI的疏水性进行分析，且对其二级结构和微观结构变化进行表征。结果表明：随着水解度的增加，SPI的表面疏水性呈增长趋势。通过不同DH下制备的SPI的电泳分析，随着DH的增大，SPI被逐渐水解形成更多的低分子量多肽，且不同DH下的SPI的多肽与亚基分布相似，随着DH的增大，SPI的低分子量多肽含量先增大后降低，新增的聚集肽含量增多。不同DH下的SPI，皆呈单个球状蛋白分布，分布较为松散，每个球状蛋白上皆有亚基分布，大部分球蛋白球体表面呈塌陷状态，随SPI的DH增大，SPI的球蛋白表面塌陷越明显，且亚基未被解离。
关键词：大豆分离蛋白；水解度；表面疏水性；结构表征
蛋白可分为植物蛋白和动物蛋白，其中大豆蛋白是含量最为丰富的优质蛋白质之一[1-2]，具有以下几点优势：1）大豆蛋白含有人体所需的8种必需氨基酸，且比例合理，皆符合WHO的标准；2）我国生产大豆，因此大豆蛋白来源广泛，价格相对低廉；3）大豆蛋白为天然植物蛋白，不含胆固醇，并且符合人体健康的需求；4）大豆蛋白具有优良的乳化性、发泡性和凝胶性，是食品工业应用的重要蛋白质。但大豆蛋白由于其分子量大、溶解度低、含有抗营养因子以及具有抗原性等因素而大大限制了大豆蛋白产品的应用领域[3]。目前针对大豆蛋白的改性研究则比较集中于化学方法和酶改性方法。但在化学方法改性的过程中会添加一些化学试剂，因此不能直接用于食品中；蛋白质酶促水解是在水溶液中通过酶的催化作用，使蛋白质中的肽键断裂，生成胨、肽等低分子量产物的生化反应过程。蛋白质经酶水解有助于改善其营养价值和功能性质，从而拓宽其应用范围。大豆蛋白水解能改善溶解度、乳化性、起泡性等功能性质以及降低过敏性，产品能应用于乳制品、肉类、饮料以及婴儿食品中，在食品蛋白质配料加工方面有着特殊意义[4-7]。
本研究采用中性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解，测定其水解度与蛋白表面疏水性关联曲线，通过SDS-PAGE凝胶电泳与扫描电镜对酶解后的大豆分离蛋白的结构和微观结构进行表征，旨在更好了解中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的机理，并为开发大豆分离蛋白酶解产物提供理论基础。
大豆分离蛋白：山东禹王生态食业有限公司；中性蛋白酶：（100 000 U/g，杰能科生物工程有限公司，中国）被保存于-4℃。其它试剂皆为分析纯。
F-4500荧光分光光度计、SN-3400扫描电镜：日本日立公司；DYY-8C电泳仪、DYY-8C电泳槽：北京市六一厂；Gel k8160凝胶成像分析系统：北京鸿涛基业科技发展有限公司；DK-98-11A电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；868型pH计：上海热电仪器公司。
利用GB/T23527-2009《蛋白酶制剂》中蛋白酶活力的测定方法，采用福林酚法测定蛋白酶活力，酶活力单位为U/mL。
经李和平[8]等的方法稍作修改后，利用中性蛋白酶对SPI进行水解。称取20 g SPI溶于蒸馏水中，使其底物浓度为5%，于90℃水浴锅中预热10 min，用1 mol/LNaOH调节溶液pH值至7.0，溶液冷却至45℃，加入0.8%（质量分数）中性蛋白酶，于45℃水浴锅中恒定pH值7.0缓慢搅拌一定时间。将水解后溶液置于90℃水浴中灭酶20 min，冷却至室温后，加蒸馏水稀释剪切后进行喷雾干燥，得到酶解大豆分离蛋白。
将SPI经水解后得到的溶液采用Alder-Nissen方法进行水解度测定[9]。水解度被定义为被破坏的肽键数（h）占单位重量总肽键数（htot）的百分比，通过加入的NaOH维持pH值恒定的量计算水解度，计算公式如下式（1）所示：
式中：B为维持水解时的pH值恒定的NaOH体积数，mL；Nb为常量；Mρ：蛋白质质量（g，%N×6.25）；1/α为pH-stat方法的校准因子；htot：肽键含量。
经Seronei方法稍作修改[10]后，对SPI样品进行表面疏水性测定。用1-苯胺-8奈（ANS）作为荧光探测剂。用磷酸缓冲液稀释（0.01 mol/L，pH7.0）稀释酶解后的SPI样品为不同浓度（0.005%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%），用0.01 mol/L pH值为7.0的磷酸缓冲溶液配制成8.0 mmol/L的ANS，并将20 μL ANS与酶解后的SPI样品溶液混合，于激发波长390 nm和发射波长470 nm测定荧光强度（FI）。以荧光强度对蛋白浓度作图，回归曲线的初始斜率为表面疏水性。
将不同水解度下的SPI样品与Tris缓冲溶液（0.06 mol/L，pH 6.8）混合，其中含β-巯基乙醇（体积分数 5%）、甘油（25 g/100 mL）、SDS（2 g/100 mL）、溴甲酚蓝（0.1 g/100 mL），于沸水浴中加热5 min后用于SDSPAGE凝胶电泳分析。
该SDS-PAGE凝胶电泳采用3层不连续胶的混合使用，即分离胶＋夹层胶＋浓缩胶结构，此3层胶皆由不同比例组成的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺混合液聚合形成。凝胶的配制方法如表1所示。
表1 分离胶、夹层胶和浓缩胶的组成
Table 1 Composition of separating gel，laminated gel and concentrate gel
注：T表示丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的总浓度；C表示甲叉丙烯酰胺占总浓度的比例。
分离胶、夹层胶和浓缩胶的胶体积比为4∶1.5∶1（体积比）。电泳时，先将电压调至80 V，待指示前沿到达分离胶时，把电压调至120 V，直至电泳结束。电泳结束后，将胶片染色12 h（考马斯亮蓝R-250染色液：42%的95%乙醇和10%冰乙酸，0.1 g）。染色结束后用脱色液（包含7%甲醇，30%冰乙酸）洗脱胶片，直至蛋白质条带变为清晰为止。并采用凝胶成像系统软件Labwork 4.5软件进行处理并分析[11]。
取适量不同水解度的SPI样品均匀粘在扫描电镜观察台上，用离子溅射镀膜仪在蛋白表面喷金，约10 nm厚。处理好的样品置于样品盒中，加速电压为20 kV，用扫描电子显微镜放大500倍下观察SPI的微观结构[12]。
除非另有说明，所有实验重复3次，并且结果表示为重复分析的平均值±标准偏差。利用SPSS系统对数据进行方差分析（ANOVA）分析和最小显著差异（LSD）实验。显着性水平设定为P＜0.05。
对比水解SPI不同时间对其水解度的影响。选择1 h～7 h进行水解，每隔1 h对水解度进行测定，SPI被中性蛋白酶水解曲线如图1所示。
图1 SPI水解不同时间对水解度的影响
Fig.1 Influence in hydrolysis degree over time of SPI
由图1可知，随着酶解时间的延长，水解度程增长趋势。在SPI水解初期，水解度明显增长，之后其增长速度逐渐趋于缓慢。水解时间从1 h至7 h过程中，水解度显著增加（P＜0.05）。其中当水解 5 h～7 h时，水解度增加不显著（P＜0.05）。由水解曲线表明，水解前4小时，SPI的水解速度较快。在前4小时内，每隔1 h，测定得到的水解度均出现显著增长的变化。在水解5 h～7 h过程中，水解的增长速度趋于平缓，此时的酶促反应趋于平稳阶段，水解度无明显增加。水解度随SPI水解时间的变化趋势与Chen等利用胰蛋白酶对蛋清蛋白酶解的研究结果相似[13]，结果表明：水解1 h时，其水解的增长速度较快，之后呈降低趋势，直到5 h后水解度无明显增加。
蛋白质的疏水作用对其构象、稳定性和功能性具有重要意义。且蛋白质的表面疏水性对其分子间的相互作用也有较大影响，因此，表面疏水性是蛋白质的一个重要性质。本稳对研究了不同水解度下的SPI与表面疏水性的关系，结果如图2所示。
SPI的DH与表面疏水性的关系如图2所示，随着水解度的增长，SPI的表面疏水性呈增长趋势。当DH在6.5至18.5之间时，SPI的表面疏水性明显增加（P＜0.05）。当SPI的DH为6.5%时，其表面疏水性为
图2 SPI的水解度与表面疏水性的关系
Fig.2 Relationship between hydrolysis degree and surface hydrophobicity
对不同水解度下的SPI进行SDS-PAGE进行凝胶电泳分析，以分子量13 kDa～210 kDa的标准蛋白做对照，结果如图3所示。
图3 不同水解度下的SPI的凝胶电泳图
Fig.3 Electrophoretic pattern of different SPI in degree of hydrolysis
1～6 分别代表水解度为 6.5、7.7、13.7、18.5、20.1、21.4 下制备得到的SPI电泳图。
图3为不同水解度下制备得到的SPI电泳图，图中显示了蛋白质的分子量分布。正如图3所示：SPI经中性蛋白酶酶解后形成的SP分子量分布情况来看，少部分多肽或亚基的分子量大于210 kDa，而大部分多肽或亚基集中分布在 210kDa～20kDa（图 3，泳道 1～6）。
如图3所示，随着水解度的增大，SPI被逐渐水解形成更多的低分子量多肽，且不同水解度下的SPI的多肽与亚基分布相似（图3，泳道1～6）。通过不同水解度下制备的SPI电泳图对比，发现水解度为13.7的SPI中分子量小于20 kDa的小肽（图3，泳道3中的条带e）和水解度为18.5的SPI中分子量小于20 kDa的小肽（图3，泳道4中的条带e）含量在其他不同水解度下制备的SPI的电泳图中减小，且水解度分别为6.5、7.7、20.1、21.4的SPI的条带在17.5 kDa以下无分布（图 3-2，泳道 1、2、5、6，e条带所示）。同时，在不同水解度下制备得到的SPI的电泳图中，我们发现随着水解度的增大，SPI的电泳图中部分条带颜色先变浅后加深（图 3，泳道 1～6 的条带 a，b，c，d，泳道 6，条带 b所示）。根据其他研究者报道[19-20]，在蛋白质合成过程中，新条带的形成或条带的加深表明有新的聚集肽生成，这些聚集肽可能是由许多低分子量的肽聚集产生。因此随着水解度的继续增加，疏水集团暴露增加，亚基与亚基之间通过疏水相互作用形成聚集体，二者结合越多，所以在水解度为20.1和21.4环境下制备的SPI的该区域的条带颜色加深，聚集肽含量增加。
为了观察不同水解度下的SPI的微观结构变化，因此，分别对其进行扫描电镜测定，如图4所示。
图4 不同水解度下的SPI的扫描电镜图片
Fig.4 SEM images of different SPI in degree of hydrolysis
图 4 中（a）、（b）、（c）、（d）各图分别为不同水解度下的SPI的扫描电镜图片，其观察倍数为500倍。通过观察发现，不同水解度下的SPI微观结构分布，皆呈单个球状蛋白分布，且分布较为松散，同时每个球状蛋白上皆有亚基分布，大部分球蛋白球体表面呈塌陷状态（图4）。由图4可知，经酶解后的SPI球蛋白表面呈塌陷状，且通过不同水解度下的SPI的扫描电镜图对比可知：随SPI的水解度增大，大豆分离蛋白的球蛋白表面塌陷越明显，且亚基未被解离。
通过对水解SPI不同时间的水解度测定，同时采用荧光探针法对不同水解度下制备的SPI的表面疏水性进行测定，结果发现：随着酶解时间的延长，水解度程增长趋势。在SPI水解初期，水解度明显增长，之后其增长速度逐渐趋于缓慢；随着水解度的增长，SPI的表面疏水性呈增长趋势。通过不同水解度下制备的SPI的电泳分析，随着水解度的增大，SPI被逐渐水解形成更多的低分子量多肽，且不同水解度下的SPI的多肽与亚基分布相似，随着水解度的增大，SPI的低分子量多肽含量先增大后降低，且新增的聚集肽的含量增多。SPI微观结构分布，皆呈单个球状蛋白分布，且分布较为松散，同时每个球状蛋白上皆有亚基分布，大部分球蛋白球体表面呈塌陷状态随SPI的水解度增大，SPI的球蛋白表面塌陷越明显，且亚基未被解离。
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Structural Characterization of Soybean Protein Isolation at Different Hydrolysis Degree
HUANG Wen-xiu，LI Cheng-hui，WANG Ji-long，TANG Ming-li，ZHAO Fei，CHEN Peng
（Shandong Yuwang Ecogical Food Industry Co.，Ltd.，Yucheng 251200，Shandong，China）
Abstract：The hydrolysis of soybean protein isolated（SPI）at neutral protease，for forming soybean protein isolation at different hydrolysis degree（DH）.The surface hydrophobicity，secondary structure and microstructure of SPI have been investigated by using a combination of determination of fluorescence probe，SGS-PAGE and transmission electron microscopy（TEM）methods.The result showed that：with the increase of DH，The surfacehydrophobicity was on the rise.SPI was hydrolyzed to form gradually more low molecular weight peptides，the peptides and base were similar.With the increase of DH，the content of low molecular weight peptides was first increased and then decreased，and the content of the new accumulation peptide was increased.Distribution of SPI at different DH was single globular protein，and relatively loose，the base was distributed on each of the globular protein，sphere surface of most of the globular protein was on subsidence.With the increase of DH，the subsidence of sphere surface of globular protein was obvious，and the base was not dissociation.
Key words：soybean protein isolated；hydrolysis degree；surface hydrophobicity；structure characterization
收稿日期：2016-11-12
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.006
作者简介：黄文秀（1989—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品科学。