刘杨柳1，武小芳1，胡树样1，孙纪录1，马爱进2，*
（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071001；2.中国标准化研究院，北京100191）
摘 要：蛋白酶K是一种高活性的丝氨酸蛋白酶，不但广泛用于分子生物学和细胞生物学等领域的相关实验，而且在食品、农业、医药等领域的应用也与日俱增。从本质上说，蛋白酶K降解影响核酸提取的组蛋白、核酸酶等蛋白质，是其用于各个领域的主要基础。目前，我国尚无针对核酸提取用蛋白酶K产品的统一标准，从而给蛋白酶K产品的流通、使用和监管造成诸多不便和困难。对蛋白酶K的性质和酶活力测定方法进行分析，并对其在从各种生物材料提取核酸中的应用条件进行总结，以期为核酸提取用蛋白酶K制定相关的方法标准和产品标准提供参考。
关键词：蛋白酶K；性质；酶活力；核酸；提取
蛋白酶K（EC 3.4.21.14）来源于林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber），是一种与枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶。由于它能降解角蛋白（keratin），因此被命名为蛋白酶K[1]。它是一种高活性的广谱蛋白酶，在变性剂尿素或十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate，SDS）溶液中依然能保持较高酶活力，所以被广泛应用于各种生物材料中的DNA或RNA的提取。然而，迄今为止，我国尚未制定核酸提取用蛋白酶K的酶活力测定方法及产品标准，从而给该酶制剂的流通、使用和质量监管造成诸多不便。因此，本文对蛋白酶K的性质、酶活力测定方法以及在核酸提取过程中的应用条件进行总结分析，以期为核酸提取用蛋白酶K标准的制定与验证提供参考。
1.1 分子结构
蛋白酶K由一条肽链组成，包含277个氨基酸残基，相对分子质量为28 930。活性部位由D39、H69和S224组成，底物识别位点主要为G100-Y104和S132-G136两个片段。蛋白酶K的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌蛋白酶具有高度同源性，因此被划分为枯草芽孢杆菌蛋白酶类。蛋白酶K包含两个二硫键（C34-C124，C179-C248），两个色氨酸残基（W8，W212）和一个游离半胱氨酸（C73）[2]。X射线晶体学研究表明，蛋白酶K的三维结构为一个明确的球形折叠。蛋白酶K属于α/ β类蛋白质，包含6个α-螺旋，15个β-折叠和一个3/ 10螺旋[3]。
1.2 荧光性
蛋白酶K在295 nm处被激发，它的荧光性由两个色氨酸残基W8和W212决定。但是，两个色氨酸的光反应活性表现不同，W212要活泼得多。在pH 3～9范围内，色氨酸荧光量子产率恒定。对已激发的色氨酸进行热力灭活时，活化能需达到54 kJ/mol。这个值大幅地高于来自微生物的其他蛋白酶，因此可用来解释蛋白酶K较高的热稳定性[4]。
1.3 酶学性质
蛋白酶K具有很高的切割活性，底物识别位点能和底物组成一个3股的反平行β片层，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键断裂。α-螺旋是保持蛋白酶K活性中心构象稳定性的主要结构。α-螺旋共包含90个氨基酸残基，占残基总数的1/3，大部分残基处在伸展的β-折叠结构中。这使得整个分子有序度低，变性熵不大，比变性焓值极低，反映了酶稳定性的本质。分子中两个二硫键及两个Ca2+也对三级结构的热稳定性有贡献[5]。pH、温度、Ca2+、激活剂和抑制剂等是影响蛋白酶K活力的主要因素。
1.3.1 pH对蛋白酶K活力的影响
蛋白酶K的催化活性在pH 6～10范围内保持稳定，在pH 8～10内大幅增加。最适pH为8.0，属于中性蛋白酶。在pH 3.5～9.0，蛋白酶K分子的三维结构对pH改变不敏感。蛋白酶K在过酸、过碱性环境中将发生不可逆变性。
1.3.2 温度对蛋白酶K活力的影响
蛋白酶K在20℃～60℃范围内保留超过80%的最高活性，在37℃时酶活力最大[6]。65℃保温10 min～15 min可部分失活。95℃加热10 min，则完全失活。蛋白酶K的热变性过程符合三态模型，存在一个中间态；蛋白酶K分子内部存在酪氨酸残基对色氨酸残基的共振能量转移作用[7]。蛋白酶K的构象柔性和内部运动性强烈依赖于溶剂温度，而蛋白质自身温度对蛋白酶构象柔性的影响程度较低[8]。
1.3.3 Ca2+对蛋白酶K活力的影响
天然蛋白酶K结合着两个Ca2+。Ca1被D200的Oδ1、Oδ2和V177的羰基氧原子紧紧固定，而Ca2与 D260的Oδ1、Oδ2和T16的羰基氧原子结合不牢固[9]。
去除Ca2+会降低酶的热稳定性和一定程度的底物亲和力，但对酶的催化活性没有影响。天然的和去除Ca2+的蛋白酶K具有相似的结构性质；蛋白酶K中的一些氢键和盐桥在维持两个Ca2+位点周围的构象上起关键作用[9]。
若向反应体系中引入Ca2+，则会对蛋白酶K催化活性产生影响。在制备高聚合度的RNA过程中，EDTA存在时，蛋白酶K能迅速钝化DNase I；而加入10 mmol/L Ca2+后，即使蛋白酶浓度高达1 mg/mL，蛋白酶K也不能钝化DNase I。在存在或缺少Ca2+条件下，蛋白酶K都能钝化RNase A（污染DNase的杂质）。因此，可在Ca2+存在下用蛋白酶K处理DNase I，以选择性地去除污染物RNase A，而不会钝化DNase的活性[10]。
1.3.4 激活剂和抑制剂对蛋白酶K活力的影响
在螯合剂EDTA、巯基试剂、对氯汞苯甲酸（PCMB）、N-甲苯磺酰-L-赖氨酰-氯甲基酮（TLCK）或甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）存在下，蛋白酶K仍可保持稳定和活力。变性剂如尿素、SDS（1%）可提高它的催化活性。
蛋白酶K属于丝氨酸蛋白酶类，因此可以被苯甲基磺酰氟（PMSF）或二异丙基氟磷酸（DFP）抑制。利用一些合成抑制剂可研究抑制剂与蛋白酶K的结合机制。Betzel C等使用差值傅里叶法，测定了合成的苄氧羰基-AAA-氯甲基酮抑制剂与蛋白酶K活性中心的结合模式。抑制物通过两个共价键结合到蛋白酶K上，一个是在抑制剂的亚甲基碳和起催化作用的His 68的N∈2之间，另一个是在抑制剂的酮碳原子和起催化作用的Ser 221的Oγ之间。此外，由Ser 221的肽键NH和Asn 160的侧链NH2提供的两个氢键在氧离子洞中支持着半缩酮O-。肽抑制剂进一步以氢键连接到蛋白酶多肽链的一个三股反平行折叠片上[11]。
虽然蛋白酶K催化蛋白质水解的能力和特性与其他种类的蛋白酶显著不同，但是，目前测定蛋白酶K酶活力方法尚无特定的方法，而是沿用一般的蛋白酶活力测定方法，主要有福林（Folin）-酚法、紫外分光光度法、考马斯亮蓝法等。
2.1 福林酚法
又称Lowry法。该法以酪蛋白或变性血红蛋白为底物，在一定的温度和pH条件下，于680 nm处测定每分钟内产生的相当于酪氨酸的显色呈Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量（μmol）。该方法灵敏度较高，但操作耗时，并需严格计时，同时会受到Tris-HCl缓冲液的干扰。
2.2 紫外分光光度法
紫外分光光度法是以酪蛋白为底物，在55℃，pH 8.0的0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液中，于275 nm波长处测定1 min内蛋白酶K水解酪蛋白产生的L-酪氨酸的量（μg）[12]。
2.3 考马斯亮蓝法
该法以酪蛋白或牛血清白蛋白为底物，在一定温度和pH条件下，蛋白酶K水解酪蛋白或牛血清白蛋白，染料考马斯亮蓝G-250与未被水解的蛋白质形成蓝色络合物，在595 nm处可快速测定，从而得到蛋白酶酶活力[13]。于洁等在分离纯化生姜蛋白酶时，用考马斯亮蓝染色法测定了酶活力。此法颜色稳定，测定快速、准确，但是会受到SDS、Trition-100等物质的干扰[14]。
2.4 其他方法
国内外近年来也出现了一些有关蛋白酶K活性检测的新方法，例如流动注射分析法、DNA/溴乙锭荧光分析法、人工合成底物法等[15-16]。虽然这些方法提高了底物的特异性，但不易操作，其仪器试剂成本较高，不利于推广应用。
我国现行的涉及蛋白酶酶活力测定方法的标准有GB/T 28715-2012《饲料添加剂酸性、中性蛋白酶活力的测定分光光度法》、GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》和SB/T 10317-1999《蛋白酶活力测定法》等。这些标准对蛋白酶的种类并未作出严格限定，具有普遍性，但是不具有针对性。蛋白酶K被广泛应用于核酸分离提取中，而目前并没有针对此类用途的蛋白酶K酶活力测定的统一标准。虽然各酶制剂公司通常采用国标规定的福林酚法和紫外分光光度法测定蛋白酶K酶活力，但是其选用的底物及其浓度、缓冲液种类、pH及浓度等影响酶活力的因素参数却不尽相同，所以测定结果也不具有可比性。因此，迫切需要建立核酸提取用蛋白酶K活力测定的专用方法标准，为该酶制剂的质量控制和流通使用提供依据。
蛋白酶K可用于各种蛋白质的消化，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K在提取核酸中的应用涉及到食源性疾病预防、农业病虫害的防治、法医学基因鉴定比对和分子生物学试验研究等多个领域。应用对象包括原核生物、人体血样及组织、动植物组织、寄生虫、微生物等类别。蛋白酶K的应用条件，如工作浓度、缓冲液种类及浓度、处理时间、处理温度等条件依据样品的不同而变化。
3.1 蛋白酶K在动物细胞核酸提取中的应用
蛋白酶K可以用于昆虫基因组DNA的分离，作为植物抗虫性进一步研究的基础。王钰婷等比较了CTAB（溴化十六烷三甲基铵）法、蛋白酶K法和盐析法对桑蟥基因组DNA的提取影响。其中，蛋白酶K法是在加入样品和DNA裂解液后，加入蛋白酶K（20 mg/mL）至终浓度10 μg/mL，45℃水浴1 h。结果表明，3种方法均可以提取基因组DNA，蛋白酶K法和CTAB法DNA获得率优于盐析法[17]。韩玉翠等研究了蛋白酶K法和CTAB法对单头蚜虫DNA提取产量和质量的影响，发现无论从DNA的产量还是从质量上，CTAB法都优于蛋白酶K法，能达到测序要求，且方法简便，但成功率低于蛋白酶K法，蛋白酶K使用条件为，100 mg/mL的蛋白酶K与样品、缓冲液、SDS混合，55℃恒温消化5 h～7 h至澄清[18]。Ferreira STG等研究发现，与标准方法相比，更高的蛋白酶K量和更长的温育时间对于从骨中提取DNA质量并没有什么影响。在标准方法中，20 mg/mL蛋白酶K和样品、缓冲液混合，56℃保温隔夜处理[19]。
3.2 蛋白酶K在植物细胞核酸提取中的应用
史公军等利用SDS-蛋白酶K法，即50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA和0.012%蛋白酶K、10%SDS混合，37℃温育1 h，从不结球白菜黄化苗的线粒体中提取DNA。该法所提取的DNA纯度高，以此为PCR进行RAPD扩增，可得到清晰的扩增图谱[20]。席梦利等研究发现，10 μg/mL的蛋白酶K在37℃孵育30 min，可消化百合花蕾切片中的大部分蛋白质，并且材料RNA结构完整[21]。宋洋研究发现，用20 mg/mL蛋白酶K于42℃，100 r/min温和振荡1.5 h提取的棉花幼蕾总RNA完整性较好，纯度较高，棉酚褐化现象得到很好的抑制[22]。
3.3 蛋白酶K在微生物核酸提取中的应用
任衍春等提取高质量水稻纹枯菌（真菌）基因组DNA的最佳方法是蛋白酶K法，工作条件为20 mg/mL的蛋白酶K于37℃水浴1 h[23]。张喆等采用溶菌酶-蛋白酶K法提取单核细胞增生李斯特菌基因组DNA。结果表明，利用20 mg/mL的蛋白酶K 58℃温育50 min，所提取的DNA模板进行PCR扩增检出限最低，提取的基因组DNA适用于PCR扩增和其他分子生物学研究[24]。袁巧等对比甘氨酸聚乙二醇富集后硅胶膜离心柱法（方法A）和蛋白酶K（200 μg/mL）生物消化（37℃，350 r/min，1 h）后顺磁性硅胶基法（方法B）两种核酸提取方法，发现方法B的病毒回收率高，快捷，更适合长期监测[25]。Villarreal JV等研究了DNase I和蛋白酶K分离去除微生物参考系统和天然饮用水生物被膜中的受伤或死亡细菌的DNA[26]。
经过比较发现，商品化蛋白酶K推荐工作浓度一般是50 μg/mL～100 μg/mL，反应温度在50℃～65℃。而在国内外相关研究中，应用于核酸提取的蛋白酶K工作浓度在50 μg/mL～500 mg/mL范围，以20 mg/mL应用最广；反应缓冲液为Tris-HCl（pH 7.5～8.0），以pH 8.0应用最广；反应温度基本设定在37℃及45℃～65℃范围。由此看来，核酸提取用蛋白酶K的应用条件没有统一的规定，研究者应结合实际情况来确定蛋白酶K具体应用条件。
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Properties of Proteinase K and Its Application in Nucleic Acid Extraction
LIU Yang-liu1，WU Xiao-fang1，HU Shu-yang1，SUN Ji-lu1，MA Ai-jin2，*
（1.College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Hebei，China；2.China National Institute of Standardization，Beijing 100191，China）
Abstract：Proteinase K，a kind of serine proteinases with high activity，is not only widely used in the related experiments of molecular biology and cell biology，but also increasingly applied to food，agriculture，medicine and other fields.In essence，proteinase K can degrade histone，nuclease and other proteins that affect the extraction of nucleic acid，which is the main foundation of its application in various fields.At present，there is not any uniform standards about proteinase K production specifically used for the extraction of nucleic acid in China，which causes much inconvenience and difficulty in the circulation，application and supervision.In this essay，the property and detection method about enzyme activity of proteinase K were analyzed，and its actual application conditions in the extraction of nucleic acid from different biomaterials were also summarized.The paper was aimed at providing some reference for the formulation of method standards and production standards related to proteinase K used for the extraction of nucleic acid.
Key words：proteinase K；property；enzyme activity；nucleic acid；extraction
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.044
收稿日期：2016-08-21
基金项目：质检公益性行业科研专项（201510208-2）
作者简介：刘杨柳（1992—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品工程。
*通信作者：马爱进（1975—），男，研究员，博士。