图1 破壁前后雨生红球藻的电镜扫描图
Fig.1 SEM images of Haematococcus pluvialis before and after wall-breaking
摘 要：虾青素是一种具有众多生理功能的类胡萝卜素，经济价值极高，但是在自然界中含量较少，其最佳生物来源-雨生红球藻中含量也不超过5 %，且该藻的细胞壁较厚，虾青素提取不充分，造成部分虾青素浪费。因此，如何充分提取雨生红球藻中的虾青素已成为研究热点。就虾青素的生理功能、提取方法、雨生红球藻的破壁方法展开论述。
关键词：虾青素；雨生红球藻；细胞破碎；提取技术
虾青素是一种酮式类胡萝卜素，其分子式为C10H52O4，属不饱和化合物。相比于其他普通的抗氧化物质而言，虾青素可以通过血脑屏障进而发挥更好的抗氧化作用。最初的虾青素是在虾、蟹壳中发现的，但是含量极少。目前自然界中天然的虾青素主要存在于某些藻类、酵母、细菌中，其中雨生红球藻是天然虾青素的最佳来源[1]。该藻是一种淡水中的单细胞绿藻，在特定的条件下可以产生大量类胡萝卜素，其中大部分为虾青素。但是由于雨生红球藻的细胞壁较厚，不破壁直接提取可能会造成部分虾青素的浪费。因此如何充分提取雨生红球藻中的虾青素意义重大。本文从虾青素的概述、雨生红球藻的破壁方法、虾青素的提取方法等方面进行探讨。
1.1 理化性质
虾青素是一种红色的晶状体，熔点在216℃左右，是脂溶性化合物，不溶于水，易溶于二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、苯等有机溶剂，微溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基亚砜等溶剂。由于虾青素分子中含有共轭双键，且分子末端有不饱和的酮基和羟基，因此其电子效应比较活跃，能够吸引自由基中未配对的电子，清除游离的自由基，产生抗氧化作用。正是由于虾青素具有这样的结构，使得虾青素对光、热、氧极为敏感，长时间放置在空气中容易氧化，高温也易破坏其分子结构。
1.2生理功能
目前，随着国内外对虾青素的研究越来越热，人们对其生理功能的认识也就越来越深，主要包括抗氧化性、抑制肿瘤、提高免疫力、预防高血压、预防糖尿病[2]、预防心脑血管疾病、保护视力、保护神经等方面。现对其几种主要功能做如下介绍。
1.2.1 抗氧化功能
虾青素的分子结构使得其具有较强的抗氧化性。研究表明，虾青素是类胡萝卜素中唯一一种可以通过血脑屏障的物质，其抗氧化效果在所有类胡萝卜素中是最强的[3]，其次是α-胡萝卜素和β-胡萝卜素。较强的自由基清除能力使得虾青素对人类的身体健康起着重要作用，可以有效地防止人体各组织器官、细胞、DNA等被氧自由基氧化而造成损伤[4]、衰老等伤害。例如，通过口服虾青素或其制剂可以降低皮肤光老化的速度，增强新陈代谢，起到抗衰老的作用，且其效果要比VA、VE、番茄红素等效果好。
1.2.2 抗癌作用
研究发现癌症的病发率或死亡率与类胡萝卜素的摄入量呈负相关，其中虾青素的效果最好。Savource 等[5]发现虾青素确实可以抑制肿瘤的增殖。其机理在于，促使癌变的一个重要原因就是细胞间隙连接通讯功能被抑制或破坏[6]，而虾青素可以诱导这种功能，提高正常细胞的连接，降低癌细胞之间的连接能力，进而防止肿瘤细胞的生长、恶化[7]。Gradeler等[8]发现虾青素可以有效预防肝癌。
1.2.3 提高免疫力
Chew等[9]动物实验发现虾青素和β-类胡萝卜素均可显著提高小鼠体内淋巴细胞的功能，尤其是虾青素效果更甚。而且通过补充虾青素可以有效恢复老龄动物的部分免疫力。原因在于虾青素可以强化T淋巴细胞，产生大量的免疫球蛋白，增强白细胞介素-1的释放以及肿瘤坏死因子的能力[10-11]，进而提高机体的免疫力，降低病毒、细菌、寄生生物等对机体的侵害。
1.2.4 预防心血管疾病
动脉硬化会导致各种心血管疾病，而动脉硬化产生的原因在于体内低密度脂蛋白（LDL）含量高于高密度脂蛋白（HDL）且被氧化。人体中此类蛋白质越多，就越容易患动脉硬化。氧化后的LDL会使细胞形状变成泡沫状，增强炎性血管壁的氧化能力、使动脉变窄[12]。而虾青素可以提高HDL浓度，降低LDL含量[13]，进而预防动脉硬化。此外，虾青素还能降低动脉斑块中巨噬细胞的渗入，防止形成动脉粥样化。因此虾青素有预防动脉硬化、冠心病、高血压等功能。
1.2.5 防止紫外辐射
众所周知，当皮肤暴露于强光尤其是紫外光下会氧化损伤，严重者会产生皮肤癌。研究表明，当机体摄入足够的虾青素、β-类胡萝卜素等抗氧化剂时可有效降低光照的伤害，尤其是虾青素效果远高于其他的抗氧化剂。正是由于虾青素对光照比较敏感，因此其可以作为较好的光保护剂，可以降低皮肤受光照伤害的程度，减小皮肤光老化速度，保护皮肤健康。
雨生红球藻是天然虾青素的最佳来源，在极佳培养条件下其虾青素含量可达3 %，是目前所知的自然界中含虾青素最多的生物。但是由于雨生红球藻的细胞壁较厚，因此直接用溶剂提取并不能将虾青素完全提取出来，反而降低了虾青素的利用率，所以在提取之前一般都会先对雨生红球藻进行破壁。目前常用的破壁方法主要有物理破壁法、化学破壁法和酶法。这几类方法中，物理破壁法相比而言较好，对原料成分损失较少。而化学破壁法操作繁杂、耗时长，而且破壁过程中用到各种有机或无机试剂，成本较高，安全欠缺，产品易被化学试剂污染。酶法破壁对试验要求较高，耗时长，成本昂贵，且后续分离难度较大[14]。图1为雨生红球藻破壁前后细胞壁的结构图[15]。
2.1 物理破壁法
物理破壁法常用的有匀浆法、超声波辅助破碎法、直接研磨法、低温研磨法、冻融法等方法[16]。
2.2 化学破壁法
化学破壁法常用酸热法，即用无机酸（一般用盐酸）对红球藻的细胞壁进行处理，利用酸与细胞壁中糖类和蛋白质的作用改变细胞壁的空间结构，进而破坏细胞壁[17]。该法的破壁率在86 %～92 %之间，该法相对有机试剂而言低毒、安全性能高，且对设备要求低[18]、成本低廉，破壁效果较好。
2.3 酶法破壁
图1 破壁前后雨生红球藻的电镜扫描图
Fig.1 SEM images of Haematococcus pluvialis before and after wall-breaking
酶法破壁主要利用溶菌酶破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁中的不溶性黏多糖分解成可溶性的糖肽，导致细胞壁破裂。此外，常用的酶还有脂肪酶、纤维素酶[19]、果胶酶。该法的破壁率在70 %左右，效果不是很好，而且酶的成本较高，对工艺要求也较高，耗时较长[20]，不利于大规模生产。
表1 雨生红球藻的物理破壁方法
Table 1 Physical wall-breaking methods of Haematococcus pluvialis
效果一般，且在破壁过程中易使温度升高，破坏虾青素的生理活性。超生波辅助破碎法方法 原理 工艺参数 虾青素提取率 优缺点匀浆法 利用螺旋桨高速搅拌产生的巨大的离心力、剪切力、挤压力对细胞壁进行破粹。最佳破壁时间为22 min，以水为介质 0.7 %～0.8 % 1.0 %～1.2 % 破壁效果较好，设备成本低，操作简单；但超声工程中易发热，需不断加冷水降温，不适合大规模生产。直接研磨法 利用研磨时产生的剪切力、摩擦力等机械力将细胞壁破粹。超声波频率高，2×104Hz～2×109Hz，同时具有热效应、机械效应和空化效应，可有效破坏物质的细胞壁。超声功率400 W，每次超声5 s，总共超声25 min研磨时间1 min 1.2 %～1.5 % 破壁效果好，但研磨时易产生高温，且耗时长，虾青素暴露在空气中易氧化。低温研磨法 液氮温度为-196℃，挥发过程中会使得被研磨物变脆，更容易将细胞壁破碎。3 %～3.2 % 破壁效果最好，耗时短，能最大程度地保护虾青素不受破坏；但操作时要注意安全。冻融法 利用细胞温度的骤冷骤热使得细胞热胀冷缩，从而达到破壁效果。加液氮研磨2次，每次研磨30 s破壁温度-70℃，时间为12 h，冻融2次，水为介质。0.9 %～1.0 % 设备简单，操作容易，适合大规模的生产，适于对光、热敏感的物质；但是破壁效果一般。
虾青素的最佳来源是雨生红球藻，其含量可达藻细胞干重的3 %。但是由于虾青素对光、热、氧、酶等较为敏感，因此一般在提取过程中会损失一部分，最终得到的虾青素含量很少，这与提取方法、选择的浸提溶剂、提取时间等有关。虾青素作为一种具有众多生理功能的活性物质，其产量较少、价格昂贵，因此如何充分提取雨生红球藻中的虾青素具有广阔前景，也是目前虾青素研究的热点。
3.1 提取溶剂的选择
虾青素在极性较弱的有机溶剂中有较大的溶解度，而在极性较强的有机溶剂中溶解度却较小，因此在选择提取溶剂时要注意所选溶剂对被提取物有较好的溶解度、易与目标物分离、毒性尽可能小、价格适宜、且容易回收利用。目前，常用来提取虾青素的溶剂主要有二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、丙酮或上述溶剂不同比例的混合溶液。但是二氯甲烷的挥发性较强，且毒性大，与新鲜的雨生红球藻互溶性不好，易出现分层现象；氯仿、丙酮的毒性也很大，挥发性强，会对环境、产品造成污染，不推荐使用；乙酸乙酯的毒性相对较小，且溶解度也较好，易回收利用；乙醇毒性小，效果低于乙酸乙酯，但是二者以2∶1的比例混合后提取效果要比二者单独使用好，缺点是不利于回收利用。若是大规模提取，建议使用乙酸乙酯提取，方便回收利用，节约成本；小规模的提取测定可用二者的混合溶液。
表2 虾青素在不同有机溶剂中的溶解度
Table 2 The solubility of astaxanthin in different organic solvents
有机溶剂 溶解度/（g/L）二氯甲烷 30氯仿 10乙腈 0.5二甲基亚砜 0.5丙酮 0.2
3.2 提取方法
虾青素的提取一般包括两个阶段：先破壁再提取。提取方法主要有溶剂浸提法[21]（振荡法、超声辅助提取、微波辅助提取、磁场辅助提取等）、超临界CO2萃取法[22]、超高压辅助提取[23]、负压空化法、其他等方法。
3.2.1 溶剂浸提法
根据虾青素在不同溶剂中的溶解度选择浸提溶剂，由于二氯甲烷和氯仿毒性大，成本高，因此一般选择乙酸乙酯、乙醇作为提取剂。研究表明，乙酸乙酯与乙醇比例为1∶2时，虾青素的提取率最大。溶剂浸提法操作简便、成本低、对设备要求低，只要确定溶剂、料液比、提取温度、提取时间即可进行提取。除了水浴振荡提取外，还有微波、超声、磁场辅助提取，即将原料放入溶剂中经微波、超声、磁场处理一段时间，之后再振荡提取一段时间或者不振荡直接离心，测定虾青素的提取率。经比较发现，经上述方法处理后再振荡一段时间，虾青素的提取率要比不振荡高。但是微波、超声提取要注意温度、时间，温度过高时间过长会破坏虾青素的结构，影响其生理活性。
3.2.2超临界CO2萃取法
该法是目前较为流行的一种方法。利用超临界流体特有的溶解能力把藻中的虾青素有效地提取出来。在萃取过程中，萃取压力、温度、时间都影响着虾青素的提取率，其中萃取压力影响最大。当温度恒定时，随着萃取压力的升高，流体的溶解力也会增大，直至达最大值。该法可有效提取虾青素，在提取过程中可防止虾青素降解，但是由于虾青素的含量较低，因此需要的红球藻数量较多，会消耗大量的CO2，成本高，操作复杂，不适合大规模的工业生产。
3.2.3 超高压辅助提取法
该方法是一种新型的提取技术，其原理是利用超过100 MPa的强压作用于被提取物上一段时间，之后迅速撤掉压力，即可达到提取的目的。除了确定提取溶剂、料液比之外，作用压力和保压时间对虾青素提取率的影响也较大，尤其是作用压力。研究表明，压力在100 MPa～300 MPa之间时，提取率随着压力的升高而升高，超过此压力后，提取率增加缓慢[24]。该法工艺简便，提取效果好，耗时短，但高压有一定的危险性，操作时要注意。
3.2.4 负压空化法
负压空化法是一种全新的提取技术，原理是利用气泡的空化作用改变被提取物细胞壁的通透性，使存在于脂质中的虾青素透过细胞壁溶解出来，从而达到提取的目的。该法其中一个重要的参数是通气量，通气量过少，气泡产生量就少，导致传质表面降低，影响传质效率；通气量过大，会降低临界压力，减少小气泡数量，导致传质效率降低[25]。因此通气量的选择要适宜。与传统的提取方法相比，该法不需要破壁处理，因此缩短了提取时间。
综上所述，虾青素的提取率与破壁方法、提取方法密切相关，破壁、提取方法不同，虾青素的提取率就不同。因此选择合适的破壁方法和提取方法对虾青素的提取率至关重要。
由于虾青素的众多功能活性及较好的着色能力使其具有广泛的应用前景和巨大的市场潜力。目前虾青素主要应用于食品、保健品、养殖业、化妆品、医药等行业[26-27]，其中水产养殖业应用最为广泛。但是天然虾青素在自然界中含量较少，且由于其对光、热、氧比较敏感，因此提取制备工艺也比较复杂，造成天然虾青素的年产量较少，价格昂贵。目前全球有能力商业化养殖红球藻生产天然虾青素的企业仅有少数几家，分别是：美国Cyanotech公司、印度BioPrex公司、日本YAMAHA集团、FUJI化学集团、Biogenic公司、以色列Algatech公司。而在国内，虽然关于雨生红球藻培养虾青素以及虾青素的不同制备方法的研究已较为充分，但是还未形成规模化生产，目前只有湖北荆州天然虾青素公司初具规模，该公司是亚洲第一家从事规模化养殖雨生红球藻生产天然虾青素的企业。因此，将雨生红球藻培养天然虾青素的学术研究转向工业化生产，实现天然虾青素的大规模生产，将是未来发展的方向。
参考文献：
[1] SUSSELA MR, TOPPO K. Haematococcus pluvialis–agreen alga, richest natural source of Astaxanthin[J]. Current Science, 2006, 90: 1602-1603
[2] HUSSEIN G, NAKAGAWA T, GOTO H, et al. Astaxanthin ameliorate features of metabolic syndrome in SHR/NDmcr-cp[J]. Life Science, 2007, 80: 522-529
[3] KIM MS, KIM JY, CHOI WH, et al . Effects of seaweed supplementation on blood glucose concentration, lipid profile, and antioxidant enzyme activities in patients with type 2 diabetes mellitus[J]. Nutrition Research and Practice, 2008, 2:62-67
[4] SHEIKHZADEH N, TAYEFI-NASRABADI H, OUSHANI AK, et al. Effects of Haematococcus pluvialis supplementation on antioxidant system and metabolism in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) [J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2012, 38:413-419
[5] SAVOUREN N, BRIAND G, TOUZ A, et al. Vitamin A Status and metabolism of Cutaneous Polyamines in the Hairless Mouse After UV Irradiation: Action of β-Carotene and Astaxanthin[J]. International Journal for Vitamin and Nutrition Research, 1995, 65(2): 79-86
[6] STEWART JS, LIGNELL A, PETTERSSON A, et al. Safety assessment of astaxanthin-rich microalgae biomass: acute and subchronic toxicity studies in rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46 (9): 3030-3036
[7]王冉冉,张慧,陶正国,等.酮基类胡萝卜素的生理功能及应用研究[J].中国食品添加剂, 2011(Z1): 153-157
[8] GRADELET S, LEBON AM, BERGES R, et al. Dietary Carotenoids Inhabit Aflatoxin B1induced Liver Preneoplastic Foci and DNA Damage in the Rat [J]. Carcinogenesis, 1998, 19(3): 403-411
[9] CHEW BP, WONG MW, PARK JS, et al. Dietary β-Carotene and Astaxanthin but Not Astaxanthin Stimulate Splenocyte Function in Mice [J]. Anticancer Research,1999, 19(6B): 5223-5227
[10] MASSIMINO S, KEARNS RJ, LOOS KM, et al. Effects of age and dietary beta-carotene on immunological variables in dogs[J]. Journal of Veterinary Internal Medicine, 2003, 17(6): 835-842
[11] BOTTIGER P, LIGNELL A. Use of xanthophylls, astaxanthin e.g., for treatment of autoimmune diseases, chronic viral and intracellular bacterial infections[P]. United States Patent 6773708, 2001
[12] OHGAMI K, SHIRATORI K, KOTAKE S, et al. Effects of astaxanthin on Lipopolysaccharide- induced inflammation in vitro and in vivo invest[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2003, 44:2694-2701
[13] WU T H, LIAO J H, HOU W C, et al. Astaxanthin protects against oxidative stress and calcium-induced porcine lens protein degradation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54: 2418-2423
[14]姜玲,董庆霖,邢向英,等.雨生红球藻细胞破碎的工艺优化[J].食品研究与开发, 2010,31(7): 72-75
[15]李婷.雨生红球藻中虾青素的提取及抗氧化活性的研究[D].北京:中国科学院:硕士学位论文, 2011
[16]周湘池,刘必谦,曾庆国,等.雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)破壁方法对虾青素提取率的影响[J].海洋与湖沼, 2006, 37(5): 424-428
[17] NAGAO T, FUKAM T, HORITA Y, et al. Enzymatic Enrichment of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis Cell Extracts[J]. Journal of Oil & Fat Industries, 2003, 80(10):975-981
[18]宋光均.发夫红酵母虾青素提取分离技术的研究进展[J].大众科技, 2005, 56(6): 60-61
[19]周锦珂,李金华,葛发欢,等.酶法提取雨生红球藻中虾青素的新工艺研究[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2008, 31(9): 1423-1425
[20]倪辉,何国庆,吴光斌,等.酸法破壁条件对法夫酵母虾青素提取效果的影响[J].农业工程学报, 2005, 21(3):176-180
[21] DUANGKAMOL R, SHOTIPRUK A. Comparison of Extraction Methods for Recovery of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis [J]. Separation Science and Technology, 2011, 46: 64-70
[22] THANA P, MACHMUDAH S, GOTO M, et al. Response surface methodology to supercritical carbon dioxide extraction of astaxanthin from Haematococcus plutialis[J]. Bioresource Technology, 2008, 99: 3110-3115
[23] DENERY R J, DRAGULL K, TANG S C, et al. Pressurized fluid extraction of carotenoids from Haematococcus pluvialisand dunaliella salinaandkavalactonesfromPiper methysticum[J]. Analytica Chimica Acta, 2004, 501: 175-181
[24]郭文晶,张守勤,张格.超高压提取雨生红球藻中虾青素的工艺优化[J].农业机械学报, 2008, 39(5):201-203
[25]祖元刚,刘莉娜,薛艳华,等.负压空化法提取虾青素[J].东北林业大学学报, 2007, 35(2):59-60
[26] GUERIN M, HUNTLEY ME, OLAIZOLA M. Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition [J]. Trends Biotechnology, 2003, 21(5): 210-216
[27] KAMATH B S, SRIKANTA B M, DHARMESH S M,et al. Ulcer preventive and antioxidative properties of astaxanthin from Haematococcus pluvialis[J]. European Journal of Pharmacology, 2008, 590: 387-395
Research of Astaxanthin in the Haematococcus pluvialis
Abstract：Astaxanthin is a carotenoid and has numerous physiological functions and higher economic value. But the content of astaxanthin is less in nature and no more than 5 % in Haematococcus pluvialis which is the best biogenetic source of astaxanthin. And because of the thicker cell wall，astaxanthin can not be extracted sufficiently which cause waste of part of astaxanthin. So how to fully extract astaxanthin has become a hot research topic. In this paper，physiological functions and extract methods of astaxanthin，cell disruption technologies of Haematococcus pluvialis will be discussed.
Key words：astaxanthin；Haematococcus pluvialis；cell disruption；extraction method
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.047
基金项目：国家科技支撑计划课题（2012BAD33B00）；国家自然科学基金（21406133）
收稿日期：2014-11-12