图1 沙门氏菌
Fig.1 Salmonella
摘 要：细菌基因组DNA的提取质量直接影响以PCR为基础的快速检测结果，影响检测速度、灵敏度、检测限度等指标。其中菌体的培养浓度是重要的一个环节，过浓或浓度太低都会对后续的PCR操作带来干扰。为简单方便的测定菌体培养液的浓度，用麦氏比浊仪测定培养液中的菌体浓度，同时用平板计数法进行验证，结果表明麦氏比浊仪可达到测定目的，制定了相关菌种的标准曲线，可快速准确的测定菌液浓度。同时通过测定提取到的基因组含量，验证了与菌体浓度的相关性。另外也对比了不同的基因组提取方法的提取效率并评价，选择了最适合本试验的方法三：改良Universal Genomic DNA Extraction Lit Ver.3.0方法。
关键词：基因组浓度；PCR；标准曲线
在细菌的PCR快速检测的方法评价中，灵敏度是一项重要的指标。制备一定浓度的菌液及快速、准确的进行菌液浓度的测定是较为关键的。测定菌体数目的常用方法主要有平板稀释法、比浊法、血球计数法等[1]，平板稀释法可依据国家安全标准GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[2]进行操作计数，准确度较高，但操作繁琐，测定时间长，不能快速出具数据；比浊法是根据悬浮体的透射光或散射光的强度以测定物质组分含量的一种分析方法，当光线通过混浊溶液时，因悬浮体选择地吸收了一部分光能，并且悬浮体向各个方面散射了另一部分光线，减弱了透过光线的强度。该法主要是用于测定能形成悬浮体的沉淀物质，例如微量元素磷、硫、氯和钙等的测定，该原理可以使用比浊管和分光光度计两种方式进行测定，比浊管法很大程度上依赖于个人的观察判断，结果误差大，使用分光光度计进行测定是在可见光区该物质进行定性或定量分析，一般波长范围为400 nm～760 nm，分光光度计是现代分子生物实验室常规仪器，常用于核酸、蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。随着生命科学以及相关学科发展，对实验仪器提出了更高的要求，如对于样品量少的实验可能会存在样品的可回收、测定体积等方面的问题；另外也可通过测定菌体物质的方法来对培养的菌体质量进行衡量，主要有重量法、RNA和DNA的含量测定等，重量法主要是对菌体在不同的培养阶段取样、离心、晾干后进行称重，制作菌体质量和细菌含量的标准曲线；RNA法和DNA法都是富集菌体后用分子生物学方法提取RNA或DNA，操作步骤较多，实验过程长，对分子生物学研究实验来说较为准确。
细菌基因组DNA提取可分为DNA释放、分离和纯化、浓缩和沉淀等几个步骤。DNA释放有化学试剂法、酶解法、热沸法和机械法。有效的DNA释放是高效提取细菌基因组DNA的前提。核酸水平对食源性致病微生物快速鉴定研究中，前人曾报道过多种细菌基因组DNA提取方法。
研究发现，普通细菌基因组DNA提取方法针对肠杆菌科的革兰氏阴性杆菌都有较高的提取效率，但对含芽孢的细菌及金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌等革兰氏阳性菌的提取效率较低。贾爱荣[3]等比较改良交替冻融法、CTAB法、苯酚氯仿法、试剂盒法等4种细菌基因组DNA提取方法，认为在金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌以及芽孢杆菌的基因组DNA提取中，改良交替冻融法用时短，操作简单，成本低，能在短时间内完成大量样品的处理，满足普通PCR扩增反应的需要，可获得较好的金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌以及芽孢杆菌的基因组DNA提取方法。刘道文[4]等比较传统煮沸法、SDS裂解法、试剂盒方法，建立了沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌基因组DNA提取的硫氰酸胍-二氧化硅改良法，该方法较传统方法获得的DNA纯度、浓度更高。任晓东等[5]比较了酶解法、丙酮-酶解法、玻璃珠机械法等破壁方法，确定玻璃珠破壁法能有效破碎金黄色葡萄球菌这样的革兰氏阳性菌，而且不增加其他用来裂解细胞壁的酶类试剂，能防止其他抑制PCR反应物质的混入，提取的基因组DNA含量较高。张喆等[6]比较了溶菌酶-蛋白酶K法、氯仿/异戊醇法、液氮冻融法对单核细胞增生李斯特氏菌基因组DNA提取方法进行研究，认为溶菌酶-蛋白酶K法提取的DNA模板进行PCR扩增检出限最低，适用于PCR扩增和其他分子生物学研究。黄珮珺[7]等报道，使用丙酮悬浮金黄色葡萄球菌沉淀，破坏细菌壁的脂质结构，结合使用蛋白酶裂解细胞壁，达到更好的基因组DNA提取效果。
麦氏比浊仪采用麦氏浊度标准溶液进行标定，直接显示麦氏单位浊度值，测量范围大，无需稀释，在菌体浓度的测定中可代替分光光度计，其应用也越来越广泛。本试验使用平板稀释法计算菌液浓度进行验证，制作吸光度与菌液浓度的标准曲线，通过麦氏比浊仪的测量可准确、快速的得到菌液的浓度，为分子生物学快速方法的开发提供基础支持。培养后的菌体通过分子生物学方法提取核酸，测定基因组浓度，与麦氏比浊仪测定出的标准曲线互相验证，为分子生物学检测方法的检测限、灵敏度等方法学验证奠定基础。
1.1 菌种
猪霍乱沙门氏菌（Salmonella CICC21493），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus CICC21676），福氏志贺氏菌（Shigella CICC21534），宋内氏志贺氏菌（CICC 21535）：均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
1.2 仪器
麦氏比浊仪：法国梅里埃公司；紫外可见分光光度计：美国Thermo公司；生物安全柜：美国NUAIRE公司；全自动雪花制冰机：上海领成生物科技有限公司；涡旋振荡器：德国IKA公司；温控摇床：江苏太仓实验设备厂；生化培养箱：上海精宏实验设备公司；冷冻冷藏箱：青岛海尔公司；电子显微镜：日本奥林巴斯公司；电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；高压蒸汽灭菌锅：日本三洋公司；恒温混匀器：德国Eppendorf公司；小型冷冻离心机：德国Eppendorf公司；微量移液器：德国Eppendorf公司。
1.3 培养基
细菌增殖培养液LB肉汤、营养琼脂（NA）、志贺氏菌显色培养基、PCA计数平板琼脂：购自北京陆桥技术有限责任公司；沙门氏菌显色培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基：法国科玛嘉公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒：杭州博日科技有限公司、美国AXYGEN公司、德国Qiagen公司产品；蛋白酶K、Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0：购自宝生物工程（大连）有限公司；以上培养基的制备均按产品说明进行配制、灭菌。
1.4 菌液的制备
1.4.1 储备菌株
各菌株的冻干粉分别转入LB肉汤培养基中36℃培养24 h，在PCA上进行划线分离，得到单菌落，经生化鉴定后扩增保存，作为储备菌株。
1.4.2 工作菌株
从储备菌株转至PCA琼脂培养基36℃培养24 h。
1.4.3 测定菌液制备
取工作用菌株，无菌取一接种环在营养琼脂上划线培养，（36±1）℃培养24 h，无菌挑取单菌落接种于10 mL营养肉汤中，36℃160 r/min振荡培养24 h。
1.5 菌液计数
将培养完毕的菌液在无菌条件下用0.85 %的生理盐水进行梯度稀释，获得10-1～10-10稀释度的菌液，取5个高稀释度的菌液做计数。分别取1 mL加入平皿中，倒入约15 mL的45℃的平板计数琼脂，混匀后待琼脂凝固倒置于36℃生化培养箱中培养48 h，同时做平行和空白。肉眼观察计数，必要时使用放大镜辅助，记录各稀释度和相应的菌落数，按GB 4789.2-2010中的菌落总数的计算方法计算菌液中的菌落浓度。同时使用营养琼脂平板和PCA平板对比两种培养基的计数效果。
1.6 标准曲线制作
以培养后的麦氏比浊仪测定的数值为纵坐标，菌浓对数为横坐标，绘制标准曲线。
1.7 基因组提取与浓度测定
本试验共采用4种前处理方法提取菌体的基因组，方法概述如下：
方法一：改良Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒方法，包括收集菌体，裂解，去蛋白，去RNA，过柱，洗脱等步骤；
方法二：改良AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒方法，包括收集菌体，裂解，冰浴，分离沉淀和上清，过柱，洗脱等；
方法三：改良Universal Genomic DNA Extraction Lit Ver.3.0方法，包括收集菌体，加入钢珠、丙酮振荡破菌，裂解，去蛋白，分离有机相和水相溶液，过柱，洗脱等；
方法四：Qiagen细菌基因组提取试剂盒方法，分为革兰氏阳性菌DNA提取和革兰氏阴性菌DNA提取，二者区别在于裂解液不同，温育时间和温度不同。另外在提取过程加入96 %～100 %乙醇。
2.1 麦氏比浊仪测定的标准曲线的制作
以麦氏比浊仪测定的菌液浓度制作的标准曲线，如图1～图3所示。
图1 沙门氏菌
Fig.1 Salmonella
图2 志贺氏菌
Fig.2 Shigella
图3 金黄色葡萄球菌
Fig.3 Staphylococcus
得到的3组数据通过菌液浓度取对数作为横坐标，麦氏比浊仪测定的数据作为纵坐标，多项式二阶回归分析，得到各菌株的回归方程，相关系数均在0.99以上。通过对比3种细菌测得的麦氏比浊仪数据可以看出，在麦氏浓度1.0～1.5之间曲线的二维线性关系较好，可进一步对该范围的测定方程进行优化，得到更为简便的计算方程；在曲线的起始至McF=1.0区间内，菌液浓度的增加，曲线的变化较缓，用比浊仪测定不灵敏，一般细菌经过夜培养，菌液浓度可以达到108CFU/mL以上，这样就可以使用比浊仪进行菌液的快速测定，满足分子生物学菌体积累的要求。另外沙门氏菌和志贺氏菌都是革兰氏阴性菌，从曲线的形状和标准曲线方程来看，相似度较高，与金黄色葡萄球菌的差异较大，不能统一到相同的方程中，在试验中可针对不同的菌种建立单独的标准曲线，快速简便的确定菌液浓度，节约检测成本，提高效率，给微生物检测的快速发展提供参考。通过试验对比，福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌的增菌效率不如沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，相差一个数量级左右，营养琼脂平板和PCA平板对计数结果无差异，但营养琼脂平板上生长的菌落较大些，易于观察。
2.2 基因组提取结果
2.2.1 试验菌株的生理生化确认
试验菌株在营养琼脂上进行分离培养，接种至显色培养基，利用GB 4789系列食品安全国家标准方法对试验菌株进行镜检及相应生理生化鉴定。通过与鉴定表比对，试验菌株均符合相应菌属特征，可作为方法验证试验用菌株。
2.2.2 细菌基因组DNA的提取及纯度检测
2.2.2.1 不同细菌基因组DNA提取方法比较分析
分别使用改良Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒方法（方法一）、改良AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒方法（方法二）、改良Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0方法（方法三）及Qiagen细菌基因组提取试剂盒方法（方法四）提取供试细菌基因组DNA。用紫外可见分光光度计测定DNA浓度与纯度，对于革兰氏阴性杆菌，4种方法所提取基因组DNA的浓度均大于50 ng/μL，且方法一＜方法二＜方法三＜方法四；A260/A280在1.39～1.95之间，绝大多数待测菌株基因组DNA A260/A280在1.8～2.0之间。电泳检测所提取细菌基因组DNA，条带清晰，无拖尾降解。
经丙酮预处理结合钢珠破碎细胞的Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0细菌基因组DNA提取方法（方法三）具有较高的提取效率，DNA的浓度均大于100 ng/μL，A260/A280在1.8～2.0之间，DNA纯度高，且经济实惠，可以满足下一步对试验准确性的要求。细菌基因组DNA的提取质量直接影响以PCR为基础的快速检测结果，影响检测速度、灵敏度、检测限度等指标。本研究最终选择方法三作为细菌基因组DNA提取方法，开展工作。
2.2.2.2 革兰氏阳性细菌基因组DNA提取方法分析
对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌等革兰氏阳性菌进行基因组DNA提取，发现只有方法三、方法四所提取的基因组DNA在浓度、纯度达到较高的测试要求。
通过对4种细菌基因组DNA提取方法的比较，发现建立的改良细菌基因组DNA提取方法，在细菌破壁、DNA释放步骤中，通过丙酮、钢珠处理破坏细胞壁脂质结构，结合蛋白酶K消化，增强了细胞壁的通透性，促进了DNA的释放。本方法适用于革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌基因组DNA的提取，所提取的基因组DNA浓度、纯度高，可以满足PCR-RFLP、实时荧光PCR分析对DNA模板高质量的要求。
参考文献：
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[2]中华人民共和国卫生部. GB 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京:中国标准出版社,2010
[3]贾爱荣,张永刚,王萍,等.食品检测中革兰氏阳性菌DNA提取新方法的研究[J].食品工业, 2011(12): 104-107
[4]刘道文,陈萍,魏琼,等.沙门菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌DNA提取方法的比较[J].中国兽医杂志, 2010, 46(12): 30-32
[5]任晓东,李一松,姜毓君.优化金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取方法[J].东北农业大学学报, 2009, 40(1): 92-96
[6]张喆,吕淑霞,祝儒刚,等.单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较[J].江苏农业科学, 2011, 39(2): 67-69
[7]黄珮珺,石超,潘世扬,等.金黄色葡萄球菌DNA提取方法的改良[J].临床检验杂志, 2002, 20(2): 106
The Determination of Bacteria Concentration and Optimization of Extraction Method in the Process of Extracting Genome
Abstract：Bacterial genomic DNA extraction quality directly affect the rapid test results based on PCR，including the detection speed，sensitivity，detection limit and other indicators. The concentration of cell culture is very important，too thick or too low concentrations will bring interference to the subsequent operation of PCR. In order to get the concentration of cell culture simply and conveniently，the Maxwell nephelometer were used to determine the cell concentration in the supernatant，at the same time validated the data using the plate count method. It showed that Maxwell nephelometer could match the determination purpose and measure the concentration of bacteria quickly and accurately. The standard curve of bacteria concentration were made，
compared with the genome content，they have relevance. Different methods of extracting genome were compared to determine the extraction efficiency，at last the third：modified Universal Genomic DNA Extraction Lit Ver.3.0 method was selected.
Key words：concentration of bacteria genome；polymerase chain reaction（PCR）；standard curve
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.043
收稿日期：2014-11-06