摘 要：以乙酸乙酯和水饱和正丁醇为萃取溶剂，对八角内生真菌BJEF13的发酵液进行连续萃取，获取不同极性萃取物。对发酵原液（BR）、乙酸乙酯萃取物（EE）、正丁醇萃取物（BE）以及水残余物（WE）的总抗氧化性、DPPH自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、羟基自由基清除率以及总黄酮、总酚含量进行了测定。结果表明：各提取物都具有一定的抗氧化活性，并呈量效关系。各提取物抗氧化活性顺序为：EE＞BE＞BR＞WE。EE的抗氧化活性最强，其清除DPPH、超氧阴离子、羟基自由基的IC50分别为38、73、50 μg/mL。BR、EE、BE和WE中总黄酮的含量分别为5.65 %、30.21 %、11.59 %和1.54 %，总酚含量分别为20.43 %、55.01 %、60.82 %和10.71 %，总黄酮含量和总酚含量大小与抗氧化活性顺序基本相符。
关键词：八角内生真菌；抗氧化性；自由基；总黄酮；总酚
由于食品、医药等工业的需求，近年来人们越来越重视从自然界中寻找天然抗氧化剂，其中植物资源是目前天然抗氧化剂的主要来源[1-3]。但受资源、生态、生长周期等因素的影响，从植物中提取抗氧化剂受到很大限制。植物内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物[4]。根据内生菌与植物宿主共生理论，内生菌几乎都能产生与植物宿主相同的成分，也能产生与植物宿主相异的物质[5-6]。因此，利用植物内生菌制备天然抗氧化剂可以克服以植物为原料的缺陷，为天然抗氧化活性物质提供了丰富的来源[7-12]。
本研究采用前期分离筛选的八角内生真菌Chaetomium globosum BJEF13[13]发酵液为原料，以有机溶剂萃取法分离其提取物为不同极性部位，对不同极性部位提取物的抗氧化活性进行研究，并测定各部位总黄酮和总酚含量进行测定，为确定该菌株抗氧化作用的物质基础及其作为天然抗氧化剂的开发提供参考。
1.1 材料
1.1.1 菌株
内生真菌Chaetomium globosum BJEF13，分离自2009年4月采自南宁高峰林场的八角枝。
1.1.2 培养基
斜面及平板培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH自然）。
液体培养基：4 %葡萄糖、0.4 %的蛋白胨、0.1 % K2HPO4、0.05 %KCl、0.05 %MgSO4和0.001 %FeSO4，pH 7.5。
1.1.3 主要试剂
DPPH自由基、脱氧核糖、福林酚试剂、芦丁、磷酸钠、钼酸铵等均为分析纯；所用水为二次蒸馏水。
1.1.4 仪器
TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；LRH-150-Z型振荡培养箱：广东省医疗器械厂；SPX-250B型生化培养箱：上海跃进医疗器械厂；YXQ.SG41.280B手提式压力蒸汽灭菌器：上海华线医用核子仪器有限公司；BS223S型电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；SW-CF-ZF型超净工作台：苏净集团安泰公司；DL-5-B型离心机：上海安亭科学仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 八角内生真菌Chaetomium globosum BJEF13发酵液的制备及其萃取分级
取28℃培养7 d的Chaetomium globosum BJEF13菌株试管斜面数支，分别加入5mL无菌水，用接种环将孢子轻轻刮下，置于已灭菌的250mL三角瓶内，瓶中预先放置数粒玻璃珠，充分振摇后，用无菌脱脂棉过滤，采用血球计数法计数并调节孢子浓度为106cfu/mL～108cfu/mL，得孢子悬浮液。将孢子悬液按10 %接种量接种至盛有液体发酵培养基的250 mL三角瓶中，装液量为100 mL，共接种15瓶。接种后于28℃、150 r/min摇床培养7 d后，4层纱布过滤，收集滤液，用无菌蒸馏水定容至1.5 L。取500 mL发酵液，减压浓缩至干得发酵固形物（样品标记为BR），质量为4.8 g。量取1 L发酵液浓缩，加入无水乙醇使其浓度达80 %，4℃冰箱静置过夜，用5 000 r/min离心20 min，去除淀粉、蛋白等大分子物质。上清液减压浓缩回收乙醇后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，分别收集水层和乙酸乙酯层。乙酸乙酯层减压浓缩至干，此为乙酸乙酯萃取物（样品标记为EE），质量为0.4 g。残余水层用等体积的水饱和正丁醇萃取3次，分别收集水层和正丁醇层，减压浓缩干燥，得正丁醇萃取物（样品标记为BE）和水残余物（样品标记为WE），质量分别为1.2 g和2.4 g。
提取物样品BR、EE、BE和WE置4℃冰箱保存，测定时用甲醇配制成适当浓度溶液。
1.2.2 抗氧化性测定
1.2.2.1 总抗氧化性的测定
参照文献[14]的方法进行：移取0.1 mL不同浓度的BR、EE、BE和WE样品溶液于具塞试管中，加入5.0 mL混合溶液（内含0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸钠、4 mmol/L钼酸铵），加塞于95℃水浴中加热90 min，取出流水冷却至室温，以试剂空白为对照，测定695 nm波长处吸光度，以A695大小表征总抗氧化性能。以芦丁作为阳性对照。
1.2.2.2 DPPH自由基清除试验
参照文献[14]方法进行测定：吸取0.1 mL不同浓度的BR、EE、BE和WE样品溶液，加入3.9 mL 1.0× 10－4mol/L的DPPH溶液（乙醇为溶剂）。从加入DPPH溶液开始计时，室温下避光放置90 min后，测定517 nm波长处吸光度，记为A1。另取0.1 mL样品溶剂代替样品溶液同上操作，吸光度记为A0。按下式计算清除率：
1.2.2.3超氧阴离子自由基清除试验
采用邻苯三酚自氧化法测定超氧阴离子自由基清除性能[15]。按照表1所示依次加入各试剂至比色管中（自加入邻苯三酚时开始准确计时），快速混匀，倒入石英比色皿中，置紫外分光光度计中，以相应的参照管作为参比测定其320 nm波长处的吸光度A随时间t的变化，根据A-t曲线计算邻苯三酚的自氧化速率k0。
表1 邻苯三酚自氧化测定加样表
Table 1 Experiment of Pyrogallol Autoxidation
注：-表示不加相应的试剂。
试剂 加样量/mL参照管 样品管0.1 mol/ LTris-HCl缓冲液（pH=8.2，内含2 mol/LEDTA）4.5 4.5蒸馏水 4.3 4.3 10 mol/L HCl 0.1 -甲醇 0.1 0.1 45 mol/L邻苯三酚（内含10 mol/LHCl） - 0.1总体积 9.0 9.0
样品测定：用不同浓度样品代替表1中的“甲醇”，同法测定加入样品后的邻苯三酚自氧化反应速率k1，按下式计算相应清除率（I）：
1.2.2.4 羟基自由基清除实验
在具塞试管中加入0.2 mL不同浓度的样品溶液，0.4 mL 0.001 mol/L抗坏血酸，0.4 mL 0.001 mol/L EDTA溶液，1.8 mL 0.05 mol/L，pH 7.4的磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲溶液，0.4 mL 0.0375 mol/L脱氧核糖，0.4 mL 0.001 mol/L氯化铁溶液，最后加入0.4 mL 0.01 mol/L双氧水，最终体积为4.0 mL[16]。震荡混合均匀后于37℃水浴中保温60 min，取出冷却至室温后依次加入2 mL 1 %（g/mL）硫代巴比妥酸（TBA），2 mL 1 %的三氯乙酸，混合均匀后加塞置沸水浴中煮沸15 min，迅速冷却至室温，测定532 nm波长处吸光度，记为A1′。
用0.2 mL蒸馏水代替上述中的脱氧核糖，同法可得，吸光度记为A2′。另取0.2 mL溶剂（甲醇）代替上述中的样品溶液同法可得，吸光度记为A0′。按下式计算羟基自由基的清除率：
此处A1′- A2′是为了扣除样品溶液本身颜色的干扰。以芦丁为阳性对照。
1.2.3 总黄酮、总酚含量的测定
各样品中总黄酮和总酚含量的测定按照文献方法[14]进行，分别以芦丁和没食子酸作为标准对照，结果以固形物中百分含量表示。
2.1 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物的总抗氧化活性
按1.2.2.1所述方法，测定不同浓度BR、EE、BE和WE4种提取物和芦丁的总抗氧化性，结果如图1所示。
图1 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物的总抗氧化性能
Fig.1 The total antioxidant activities of fermentation extracts of Chaetomium globosum BJEF13
由图1可知，4种提取物均表现出一定的总抗氧化性，且随浓度的增大而增强，呈明显的量效关系。在相同的浓度下，乙酸乙酯萃取物（EE）的总抗氧化性显著强于其他3种提取物。在低浓度时（4 μg/mL），EE的总抗氧化性比芦丁高，但在较高浓度时，EE的总抗氧化性略低于芦丁。
综合上述结果，八角内生真菌BJEF13发酵液各提取物、芦丁的总抗氧化活性强弱顺序为：Rutin > EE > BE > BR > WE。
2.2 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物的DPPH自由基清除活性
按1.2.2.2所述方法，测定不同浓度BR、EE、BE和WE 4种提取物和芦丁对DPPH自由基的清除活性，结果见图2。
图2 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物对DPPH自由基的清除率
Fig.2 DPPH radical scavenging activities of fermentation extracts of Chaetomium globosum BJEF13
由图2可知，4种提取物对DPPH自由基的清除率均随浓度的增大而增大。在试验的浓度范围内，除WE外，其他提取物对DPPH自由基的的清除率均可达50 %，EE、BE、BR的IC50值分别约为38、50、100 μg/mL。四种提取物中，EE的清除活性最强，与芦丁（IC50约为37 μg/mL）相近。
2.3 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物的超氧阴离子自由基清除活性
在活体组织内，超氧阴离子自由基容易形成羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等活性更强的氧化物而引起机体损伤[17]。按1.2.2.3所述方法，测定不同浓度BR、EE、BE和WE 4种提取物和芦丁对超氧阴离子自由基的清除活性，结果如图3所示。
图3 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物对超氧阴离子自由基的清除率
Fig.3 Superoxide anion radical scavenging activities of fermentation extracts of Chaetomium globosum BJEF13
由图3可知，4种提取物中，EE和BE对超氧阴离子自由基具有较强的清除活性，其IC50值分别为100、73 μg/mL，但弱于芦丁（IC50值62 μg/mL）。BR和WE具有一定的清除活性，但在试验的浓度范围内，清除率均未达到50 %。
2.4 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物的羟基自由基清除活性
羟基自由基是生物体内活性较强的自由基，易引起DNA、脂类、蛋白质以及细胞的氧化损伤[18]。不同浓度Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物对羟基自由基的清除活性如图4所示。
图4 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物对羟基自由基的清除率
Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activities of fermentation extracts of Chaetomium globosum BJEF13
结果表明，4种样品和芦丁对照品均有较强的清除羟基自由基的能力。在所试验的浓度范围类，提取物浓度越高清除率越高。BR、EE、BE和芦丁清除羟基自由基的IC50分别为96、50、80、42 μg/mL，而WE清除能力较弱，在所试验的浓度范围内，清除率最高只有40 %左右。可见，各种样品对羟基自由基清除作用的强弱顺序为Rutin > EE > BE >BR >WE。
综合以上总抗氧化性、DPPH自由基清除、超氧阴离子自由基清除和羟基自由基清除的实验结果可知，八角内生真菌Chaetomium globosum BJEF13发酵液具有较强的抗氧化活性，各提取物的活性强弱顺序为EE > BE > BR > WE。
2.5 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物的总黄酮、总酚含量
众多研究[19-21]表明，黄酮类和多酚类物质是天然抗氧化剂的主要物质基础。为考察八角内生真菌Chaetomium globosum BJEF13抗氧化活性的物质基础与总黄酮、总酚的关系，对其发酵液提取物中总黄酮和总酚含量进行了测定，结果如表2所示。
表2 Chaetomium globosum BJEF13发酵液提取物总黄酮、总酚含量
Table 2 Amounts of total flavonoids and phenolics in fermentation extracts of Chaetomium globosum BJEF13 %
样品 总黄酮 总酚BR 5.65±0.93 20.43±3.42 EE 30.21±4.82 55.01±6.95 BE 11.59±2.62 60.82±7.08 WE 1.54±0.59 10.71±1.25
由表2可见，发酵液浓缩物（BR）经乙酸乙酯和正丁醇萃取后，其总黄酮和总酚含量均有大幅度提高，其中总黄酮含量由5.65 %分别提高至30.21 %和11.59 %；总酚含量由20.43 %分别提高至55.01 %和60.82 %。根据总黄酮和总酚测定结果，结合上述抗氧化活性测定结果可知，总黄酮和总酚是Chaetomium globosum BJEF13发酵液中主要的抗氧化活性物质。
八角内生真菌Chaetomium globosum BJEF13发酵液的乙酸乙酯、正丁醇萃取物具有较强的总抗氧化性以及DPPH、超氧阴离子、羟基等自由基清除活性，其抗氧化活性与其中的总黄酮和总酚含量呈正相关关系。其中乙酸乙酯萃取物中总黄酮和总酚含量分别可达30 %和55 %，其清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的IC50分别为38、73、50 μg/mL，与阳性对照芦丁的抗氧化活性相近。目前，对乙酸乙酯和正丁醇萃取物中抗氧化活性成分的分离、鉴定尚在进行之中。
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Study on Antioxidant Activity of Broth of An Endophytic Fungus Isolated from Illicium verum
Abstract：The fermentation broth of endophytic fungus Chaetomium globosum BJEF13 isolated from Illicium verum was extracted by the ethyl acetate and butyl alcohol successively. The antioxidant and radical scavenging activities of original broth（BR），ethyl acetate extract（EE），n-butyl alcohol extract（BE）and water extract （WE）were investigated，employing various methods established in vitro systems，such as the total antioxidant capacity measured by phosphombdenum method，scavenging activities towards 1，1-diphenyl-2-picryhydrazyl （DPPH）radical，superoxide anion radical and hydroxyl radical. The amounts of total phenolics and total flavonoids in the extracts and fractions were also determined by spectrophotometric methods. The results showed that all the extracts and fractions exhibited antioxidant and radical scavenging activities at different magnitudes of potency，which showed a dose -response relationship. The decreasing order of antioxidant and radical scavenging activities among the extracts assayed through all the four methods were found to be EE > BE > BR > WE. EE showed the strongest antioxidant activity. IC50values of DPPH radical scavenging activity，superoxide anionradicalscavengingactivityandhydroxylradicalscavengingactivityfor EEwere38，73μg/mLand50μg/mL，respectively. The amounts of total flavonoids in BR，EE，BE and WE were 5.65 %，30.21 %，11.59 % and 1.54 %，respectively. And the amounts of total phenolics were 20.43 %，55.01 %，60.82 % and 10.71 %，respectively. The results showed the extent of antioxidant and radical scavenging activities are in accordance with the amounts of phenolics and flavonoids present in extracts and fractions.
Key words：endophytic fungus of Illicium verum；antioxidant activities；free radical；total flavonoids；total phenolics
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.042
基金项目：国家自然科学基金项目（31460409）；广西矿冶与环境科学实验中心资助项目（KH2013YB013）；广西壮药产业化工程院科研项目（2014GXZYCYH03）
收稿日期：2014-08-27