表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions
流动相组分 比例/% 0 min 8 min 9 min 11 min 12 min 20 min乙腈 10 45 70 70 10 10磷酸二氢钾 90 55 30 30 90 90
摘 要：利用高效液相色谱法同时测定饮料中安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和脱氢乙酸。用ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离，以甲醇∶乙酸铵（pH= 6.5）=5∶95（体积比）为流动性，利用二极管阵列检测器（DAD）检测样品，外标法定量分析。结果浓度在1 μg/mL～200 μg/mL时，各组分的校准曲线的相关系数分别为：安赛蜜（0.999 6）；苯甲酸（0.999 5）；山梨酸（0.999 7）；糖精钠（0.999 5）；脱氢乙酸（0.999 8）。两种样品的回收率范围为：95 %～105 %。表明该方法快速、准确、简便。
关键词：安赛蜜；苯甲酸；山梨酸；糖精钠；脱氢乙酸
饮料是指以水为基本原料，由不同的配方和制造工艺生产出来，供人们直接饮用的液体食品。为了适应消费者的口感需求、延长保质期，厂家在生产过程中增加口味、添加安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和脱氢乙酸等添加剂。过量的添加对人体有一定的毒害副作用，在食品添加剂使用标准中[1]明确规定了些添加剂的使用范围和相应限量。目前，我国国标[2-6]和文献[7-12]中一般正对这些添加剂中的一种或者几种的检测方法进行描述，很少研究饮料中同时对这5种添加剂进行检测的方法。为了提高工作效率，本试验利用高效液相色谱法（DAD检测器），对5种被测组分进行光谱扫描，寻求最佳的检测参数。再对饮料中这5种添加剂进行同时检测。本方法快速准确、操作简单，有利于饮料中5中添加剂的测定。
1.1 仪器与试剂
安捷伦1260高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器、四元泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器、Open LAB工作站：安捷伦科技有限公司；梅特勒XS205DH电子天平（万分之一）：梅特勒；DV-S26电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；Neofuge 18R台式高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；甲醇、乙腈：HPLC级，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气；氨水溶液：氨水和水的体积比为1∶1；乙酸铵溶液（0.02 mol/L）：取1.54 g乙酸铵，加水溶解至1 000 mL（用乙酸调pH=6.5），经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气；硫酸铵（0.02 mol/L）：称取硫酸铵2.642 g，加水溶解，加1 mL 10 %的硫酸，加水定容至1 000 mL，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气；磷酸二氢钾溶液（20 mmol/L）：1.36 g无水磷酸二氢钾，加水定容至500 mL，经0.45 μm滤膜过滤，超声脱气；20 g/L的氢氧化钠溶液：称取20.0 g氢氧化钠，用水定容至1 L；安赛蜜（1.00 mg/mL）：农业部环境保护科研监测所；山梨酸、苯甲酸、糖精钠（1.00 mg/mL）：中国计量科学研究院；脱氢乙酸标准储备液：准确称取100.50 mg脱氢乙酸（99.5 %，上海安谱科学仪器有限公司）加10 mL 20 g/L的氢氧化钠溶液溶解，用水定容至100 mL，配制成1.00 mg/mL的标准储备液。
1.2 样品
市售饮料：绿力冬瓜茶；美年达橙味汽水。
1.3 色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶乙酸铵（pH 6.5）=5∶95（体积比）；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：230 nm，扫描波长：210 nm～400 nm；进样量：10 μL。
1.4 标准曲线
分别取1.00 mg/mL的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸各5.0 mL于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得200 μg/mL的混合标准溶液。取该混合标准溶液，依次配制成浓度为1、2、10、20、100 μg/mL的混合标准溶液。这6个梯度标准溶液各自进样10μL，按照色谱条件进行检测，根据保留时间、峰面积及对应的浓度分别作校准曲线。
1.5 样品处理
称取2 g～5 g样品（精确至0.01 g）（如含有乙醇需水浴加热除去乙醇后再用水定容至原体积）于25 mL容量瓶中，用氨水（1+1）调节pH至近中性，用水定容至刻度，混匀，经0.45 μm滤膜过滤；滤液待上机分析。
2.1 流动相的选择
表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions
流动相组分 比例/% 0 min 8 min 9 min 11 min 12 min 20 min乙腈 10 45 70 70 10 10磷酸二氢钾 90 55 30 30 90 90
试验中选择乙腈和磷酸二氢钾溶液（20 mmol/L），按照（表1）进行梯度洗脱时，安赛蜜和糖精钠发生重合。使用硫酸铵（0.02 mol/L）∶甲醇∶乙腈= 80∶15∶5为流动相时，安塞蜜和糖精钠的响应值较高，而山梨酸和苯甲酸的响应值较低。以甲醇和乙酸铵溶液（0.02 mol/L）=5∶95为流动相时，5种添加剂分离效果较好，且各物质的响应值都相对较高。
选择甲醇和乙酸铵溶液（0.02 mol/L）为流动相。由于流动相的pH对各组分的分离影响较大，用乙酸和氨水分别调节乙酸铵溶液的pH为5.5、6.5、7.5，当使用pH为6.5时，5种添加剂的分离效果最好，出峰顺序为安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸（如图1）。故本试验采用该流动相体系对样品中各组分进行分析。
图1 安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸标样色谱图
Fig.1 HPLC spectrum of acesulfame potassium、benzoic acid、sorbic acid、saccharin sodium and dehydroacetic standard sample
2.2 波长选择
利用二极管阵列检测器（DAD）对安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠、脱氢乙酸分别进行波长扫描。结果（如图2～图6）表明：各组分的最大吸收波长分别为：安赛蜜226 nm、苯甲酸222 nm、山梨酸254 nm、糖精钠206 nm、脱氢乙酸230 nm和295 nm，综合考虑各组分的响应值，选择230 nm的波长为检测波长。
图2 安赛蜜吸收光谱图
Fig.2 HPLC spectrum of acesulfame potassium standard sample
图3 苯甲酸吸收光谱图
Fig.3 HPLC spectrum of benzoic acid standard sample
2.3 标准曲线线性范围及线性关系
选择混合标准溶液的浓度分别为1、2、10、20、100、200 μg/mL，进高效液相色谱仪分析后，以各个组分的峰面积和浓度绘制标准曲线，以3倍性噪比计算检出限。结果见表2。
图4 山梨酸吸收光谱图
Fig.4 HPLC spectrum of sorbic acid standard sample
图5 糖精钠吸收光谱图
Fig.5 HPLC spectrum of saccharin sodium standard sample
图6 脱氢乙酸吸收光谱图
Fig.6 HPLC spectrum of dehydroacetic standard sample
表2 各组分标准曲线及检出限
Table 2 The detection limit of components and standard curve
组分 回归方程 相关系数r检出限/（μg/mL）安赛蜜 Y=31.251 54X+4.774 26 0.999 6 0.04苯甲酸 Y=40.401 68X+0.880 417 0.999 5 0.03山梨酸 Y=73.205 41X+0.847 733 0.999 7 0.02糖精钠 Y=26.759 92X-0.160 253 0.999 5 0.05脱氢乙酸Y=60.861 91X-28.585 87 0.999 8 0.02
2.4 方法精密度和加标回收率
取6份空白样品分别加入50 μg/mL的混合标准物质1 mL于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度。结果见表3。以绿力冬瓜茶（样1）和美年达橙味汽水（样2）为试样，分别加入一定量的混标，计算回收率。两种样品的回收率范围为：95 %～105 %。结果见表4。
本试验表明，利用高效液相色谱法同时测定饮料中的安赛蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精钠和脱氢乙酸，各组分分离效果较好，标准曲线线性较好，回收率较高。方法操作简单，能有效提高饮料中添加剂的检测效率。
μg/mL
表3 精密度试验结果
Table 3 The precision of the result of the experiments
组分名称 安赛蜜 苯甲酸 山梨酸 糖精钠 脱氢乙酸1 1.991 47 2.000 11 2.001 41 1.992 42 1.985 22 2 1.985 24 2.010 42 2.001 12 1.985 42 1.958 63 3 2.021 51 1.998 57 2.010 24 2.021 47 1.914 52 4 2.001 75 1.952 45 1.981 74 2.065 14 2.035 42 5 1.982 01 1.985 28 1.965 74 1.958 93 2.075 20 6 1.950 11 2.001 40 1.954 21 1.952 63 1.954 24 RSD/% 1.19 1.04 1.12 2.10 2.96
表4 样品加标回收率
Table 4 The recovery of the standard addition
组分 样品 样品含量/ （mg/kg）测定值/ （mg/kg）加标量/ （mg/kg）回收率/%安赛蜜 1 0 50.002 14 50 100.00 2 0 50.040 20 50 100.08苯甲酸 1 0 49.585 68 50 99.17 2 110.11 159.885 24 50 99.55山梨酸 1 0 49.855 86 50 99.71 2 0 49.885 74 50 99.77糖精钠 1 0 48.521 01 50 97.04 2 0 47.595 05 50 95.19脱氢乙酸 1 0 49.201 45 50 98.40 2 0 48.071 12 50 96.14
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[12]景立新,张岩,张黎黎,等.高效液相色谱法同时测定饮料中苯甲酸和山梨酸[J].光谱实验室,2008,25(3):351-355
Determination of Five Addtives in Beverage by High Performance Liquid Chromatography
Abstract：The determination of acesulfame potassium，benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium and dehydroacetic in beverage by high performance liquid chromatography（HPLC）. The analysis was performed on a ZORBAX SB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate solution（pH= 6.5，5∶95（Volume ratio）as the elution，with the external standard curve. The linear range of menthod was in the range of 1 μg/mL-200 μg/mL：acesulfame potassium（r=0.999 6），benzoic acid（r=0.999 5），sorbic acid（r=0.999 7），saccharin sodium（r=0.999 5）and dehydroacetic（r=0.999 8）.The recoveries for samples ranged from 95 %-105 %。This method was proved to be simple，rapid and accurate.
Key words：acesulfame potassium；benzoic acid；sorbic acid；saccharin sodium；dehydroacetic
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.041
收稿日期：2014-11-04