图1 样品色谱图
Fig.1 The chromatogram of the sample
摘 要：建立保健食品中β-胡萝卜素含量的测定方法。采用高效液相色谱法，色谱柱：岛津Inertsil C18（4.0 mm× 75 mm，3 μm），以甲醇∶乙腈=90∶10为流动相，流速1.0 mL/min。结果：β-胡萝卜素的浓度与峰面积线性关系良好（R2=0.999 81），平均回收率为99.4 %，RSD=0.4 %（n=9）。因此，高效液相色谱法可靠、灵敏、快速，可用于保健食品中β-胡萝卜素含量测定。
关键词：β-胡萝卜素；保健食品；高效液相色谱；含量测定
β-胡萝卜素是类胡萝卜素之一，是橘黄色脂溶性化合物，它是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素。β-胡萝卜素分子式为C40H56，紫红或暗红色的结晶性粉末。不溶于水，微溶于乙醇和乙醚，易溶于氯仿苯和油。熔点176℃～180℃。β-胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。β-胡萝卜素比较稳定，效力也强，β-胡萝卜素的分子结构相当于2个分子的维生素A，进入机体后，在肝脏及小肠粘膜内经过酶的作用，其中50 %变成维生素A，有补肝明目的作用，可治疗夜盲症。目前常用于测定β-胡萝卜素的方法主要有紫外分光光度法[1]和高效液相色谱法[2-3]。本文主要是基于国标GB/T 5009.83的液相方法的基础上，优化前处理，使方法能简便，准确，快速的测定保健食品中β-胡萝卜素。
1.1 仪器和试剂
甲醇（色谱纯）：德国CNW；乙腈（色谱纯）：德国CNW；石油醚（分析纯，沸程30℃～60℃）：广州化学试剂厂；三氯甲烷（分析纯）：广州化学试剂厂；β-胡萝卜素对照品（来源：Dr；批号：20402；含量：96.3 %）；多种维生素片（女士）。
超声波清洗器（EQ-500，昆山市超声仪器有限公司）；高效液相色谱仪（安捷伦1260，美国安捷伦公司）；色谱柱：岛津Inertsil C18，4.0 mm*75 mm，3 μm。
1.2 色谱条件
流动相：甲醇∶乙腈=90∶10；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；进样量：10 μL。
1.3对照品溶液的配制
1.3.1 对照品贮备液的配制
精确称取β-胡萝卜素对照品10.32 mg于100 mL容量瓶中，用约50 mL三氯甲烷溶解后，再用石油醚（沸程30℃～60℃）定容至刻度，超声2 min，使β-胡萝卜完全溶解，放冷至室温，摇匀，放在-18℃的冰箱中储存备用。
1.3.2 对照品溶液的配制
对照品溶液的制备：精密吸取β-胡萝卜素贮备溶液5.00 mL于50 mL容量瓶中，加入甲醇∶乙腈=7∶3混合液至刻度，摇匀，即得β-胡萝卜素对照溶液。
1.3.3 标准工作曲线绘制
分别精密吸取β-胡萝卜素对照品溶液1、2、5、10、15 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇∶乙腈=7∶3混合液至刻度，摇匀，即得β-胡萝卜素标准使用液，分别得到浓度为0.198 763 2、0.397 526 4、0.993 816、1.987 632、2.981 448 μg/mL的工作标准溶液，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，进样量为10 μL，以浓度C（μg/mL）为横坐标、峰面积A为纵坐标，绘制标准工作曲线。
1.4 供试品溶液的制备
精密称取0.2 g研磨均匀细腻的样品，置于50 mL棕色容量瓶中，加入约2/3的甲醇∶乙腈=7∶3混合液，混匀，35℃超声20 min，定容，取上清液经0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。
1.5 线性试验
将标准品贮备液分别吸取5个适量的体积，加甲醇∶乙腈=7∶3混合液配成0.198 763 2、0.397 526 4、0.993 816、1.987 632、2.981 448 μg/mL 5个浓度，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，每个浓度以10 μL注入色谱系统。
1.6 精密度试验
称取6份样品，按1.4试样制备方法处理样品，检测样品含量，计算其RSD（%）。
1.7 加标回收率试验
加标样品的处理：精密称取0.2 g研磨均匀的样品9份，于50 mL容量瓶中，分成3组，每组3份，于每一组中分别精密加入浓度为9.938 16 μg/mL β-胡萝卜素标准工作液1.6、2.0、2.4 mL。加入约2/3的甲醇∶乙腈=（7∶3）混合液，混匀，35℃超声20 min，定容，取上清液经0.45 μm的微孔滤膜过滤，作为加标溶液；取该加标溶液10 μL进样。
1.8 稳定性试验
试验方法：取β-胡萝卜素样品溶液（浓度为0.993 816 μg/mL）分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h取进样，进样量为10 μL，计算其峰面积的相对标准偏差RSD（%），考察该方法的稳定性。
2.1 色谱条件
2.1.1 色谱柱
β-胡萝卜素是类胡萝卜素的一种，有时候会受同类物质的影响，很难分离，而本文采用了岛津Inertsil C18（4.0 mm×75 mm，3 μm）色谱柱，能达到分离的要求，同时检测时间也比较快。
2.1.2 检测波长
试验证明在448 nm的波长处，绝大多数的杂质没有紫外吸收，而β-胡萝卜素灵敏度却较高，所以波长448 nm出的峰形很好，见图1。
图1 样品色谱图
Fig.1 The chromatogram of the sample
2.1.3 溶剂的选择
试验证明采用甲醇∶乙腈=7∶3混合液对样品提取，回收率在98.31 %～101.45 %，能很好的提取样品中β-胡萝卜素，而且处理方法简单、耗时短。
2.2 线性试验
线性试验结果见表1。
表1 线性试验结果
Table 1 Linear experimental results
标准序号 浓度C/（μg/mL） β-胡萝卜素的峰面积（A）STD1 0.198 763 2 30.550 47 STD2 0.397 526 4 57.972 92 STD3 0.993 816 145.340 62 STD4 1.987 632 299.850 01 STD5 2.981 448 436.300 75
以标准品的5个梯度浓度与其峰面积进行线性回归，拟合线性方程为y=147.3531 5x+0.584 801，R2= 0.999 81，在浓度为0.198 763 2 μg/mL～2.981 448 μg/mL之间呈现良好的线性。
2.3 检出限和定量限试验
分析方法的检出限DL和定量限QL由信噪比（S/ N）计算。DL定义为S/N=3时对应的待分析物浓度，QL定义为S/N=10时对应的分析物浓度。
2.3.1检出限
精密量取浓度为9.938 16 μg/mL的β-胡萝卜素工作标准溶液1 mL～250 mL容量瓶中，加甲醇∶乙腈= 7∶3混合液至定容，即得浓度为0.039 752 64 μg/mL的标准品溶液。
取信噪比为（3∶1）定方法的检测浓度为：DL（β-胡萝卜素）＝0.039 752 64 μg/mL，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.039 752 64 μg/mL×50 mL/ 0.2 g=9.938 16 μg/g。
2.3.2 定量限
取信噪比为（10∶1）定方法的检测浓度为：DL（β-胡萝卜素）＝0.131 183 712 μg/mL，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.131183712μg/mL×50mL/ 0.2 g =32.795 928 μg/g。
2.4 精密度试验
精密度试验结果见表2。
6份样品含量的RSD为0.7 %，表明该方法有良好的精密度。
2.5 稳定性试验
稳定性试验的结果见表3。
结论：β-胡萝卜素溶液分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h，其峰面积的RSD为2.0 %，表明β-胡萝卜素溶液在室温下24 h内的稳定性较好。
表2 精密度的试验结果
Table 2 The precision of experiment results
序号 称样量/g 浓度/ （μg/mL）含量/ （μg/g）平均含量/（μg/g） RSD/% 1 0.205 55 0.413 282 100.53 99.9 0.7 2 0.209 87 0.422 240 100.59 3 0.203 02 0.402 120 99.03 4 0.201 35 0.400 489 99.45 5 0.205 27 0.410 994 100.11 6 0.200 13 0.398 682 99.60
表3 稳定性试验的结果
Table 3 The stability of experiment results
放置时间/h β-胡萝卜素的峰面积（counts）0 145.635 21 2 144.605 48 4 143.024 65 8 143.380 41 12 140.987 46 24 138.025 68
2.6 加标回收率试验
加标回收率试验见表4。
表4 加标回收率试验结果
Table 4 The recoveries of experiment results
序号 样品称样量/g 样品的浓度/（μg/mL） 测得对照品量/μg实际加标量/μg 回收率/% 平均回收率/% RSD/% 1 0.201 35 0.719 280 15.829 00 15.901 056 99.54 99.4 0.4 2 0.207 89 0.738 425 16.132 25 15.901 056 101.45 3 0.201 49 0.715 633 15.632 65 15.901 056 98.31 4 0.200 21 0.796 050 19.781 50 19.876 320 99.52 5 0.209 18 0.812 028 19.683 40 19.876 320 99.02 6 0.202 19 0.796 811 19.621 55 19.876 320 98.71 7 0.209 31 0.889 495 23.543 75 23.851 584 98.70 8 0.209 12 0.893 755 23.775 75 23.851 584 99.68 9 0.207 83 0.889 099 23.671 95 23.851 584 99.24
从表4中可以看出多种维生素片（女士）中平均回收率为99.4 %，相对标准偏差（RSD）为0.4 %。
本文采用甲醇∶乙腈=90∶10作流动相，经岛津Inertsil C18（4.0 mm×75 mm，3 μm）色谱柱，使用高效液相色谱法，能很快把多种维生素片（女士）中β-胡萝卜素分离，进行检测。通过测定线性关系，检出限，定量限，精密度，稳定性和回收率，表明该方法用于测定β-胡萝卜素的含量，结果令人满意。
参考文献：
[1]陆磊.农产品中β-胡萝卜素检测方法的应用与研究[J].甘肃科技,2009,25(23):40-41
[2]郑群雄,杜美霞,徐小强,等.高效液相色谱法测定15种蔬菜中β-胡萝卜素[J].食品科学,2012,33(14):238-241
[3]鄂来明,周红,潘斌全.高效液相色谱法测定奶粉中β-胡萝卜素[J].中国乳品工业,1999,27(24):29-31
Determination of β- Carotene in Health Foods by HPLC
Abstract：To establish a method for determination of β- carotene in health foods. Methods：high performance liquid chromatography（HPLC），column：using Shimadzu Inertsil C18column（4.0 mm×75 mm，3 μm），Methanol∶Acetonitrile = 90∶10 as the mobile phase，flow rate：1.0 mL/min. The linear relationship between βcarotene concentration and peak area are good（R2= 0.999 81），the average recovery was 99.3 %，RSD = 0.4 % （n = 9）.Conclusion：The method is reliable，sensitive，rapid and can be used for determination of β- carotene in health foods.
Key words：β- carotene；health food；HPLC；determination
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.040
收稿日期：2014-11-06