图1 标准曲线的测定
Fig.1 Determination of standard curve
摘 要：讨论紫甘薯中花青素的微波辅助提取及可见分光光度法定量检测方法。结果表明：在520 nm下测定样品中花青素的吸光度，相对标准偏差为5.26 %（n=6），加标平均回收率为97.8 %，最低检测浓度为0.835 μg/mL。该方法简便准确，可用于紫甘薯中花青素含量的测定。
关键词：紫甘薯；花青素；微波消解；可见分光光度法
紫甘薯富含花青素类色素，且有较好的光、热稳定性。近年来的研究表明，紫甘薯色素具有清除自由基、抗氧化、抗突变、降血压，改善肝机能等多种生理功能，在食品、化妆品及医药等行业中有着广阔的应用前景[1-2]。目前，紫薯花青素的检测方法大都仅是定性分析，主要有色谱法和紫外可见分光光度法。由于紫甘薯色素成苷化和酰基化的多样性，采用色谱法直接测定需要多种标准品，成本昂贵[3-4]，花青素在可见光500 nm～550 nm内，具有强烈吸收，并且糖苷化和酰基化对其可见光谱性质的影响不大，使得可见分光光度法成为一种切实可行的检测方法。
本试验采取微波消解提取紫甘薯中的花青素，并用分光光度法对其含量进行了测定。微波消解提取具有设备简单、适用范围广、萃取效率高、重现性好、节省时间、节省试剂及污染小等特点。
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器
722型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；HH-S恒温水浴锅：江苏省金坛市正基仪器有限公司；DHG-9240烘干箱：上海一恒科学仪器有限公司；P7023TP-KT型格兰仕微波炉：中国格兰仕电器公司；pHS-3C型数字酸度计：杭州东星仪器设备厂。
1.1.2 试剂
紫甘薯1 kg：市售；纯品原花青素：河北天福园生物科技有限公司；无水乙醇、甲醇、浓盐酸和香草醛等，均为分析纯。
1.1.3 显色剂配制[3]
香草醛-甲醇溶液：准确称取2.0 g的香草醛，用甲醇定容至100 mL，配成浓度为1 %（mg/L）的香草醛-甲醇溶液。
浓盐酸-甲醇溶液：准确量取15 mL的浓盐酸，用甲醇定容至100 mL，配成浓度为15 %（mL/mL）的浓盐酸-甲醇溶液[5]。
显色剂[显色剂：1 %香草醛甲醇溶液∶15 %盐酸甲醇溶液=1∶1（mL/mL）]
1.2 紫甘薯中花青素微波提取试验
1.2.1 试验原理
在酸性条件下，原花青素与香草醛反应生成红色产物，由红色产物的吸光度可确定花青素的含量。首先扫描出反应体系的最大吸收波长，在此波长下，考察提取溶剂、盐酸用量、提取时间、提取温度、提取料液比和提取微波时间的影响，确定最佳条件，绘制花青素的标准曲线，作为检测花青素含量的依据[6]。
1.2.2 样品处理
取新鲜紫甘薯，用去离子水洗净后，切片，在烘箱内低温烘干，备用。
1.2.3 紫甘薯中花青素的提取
称取100 g左右紫甘薯粉末，在60℃的鼓风干燥箱中烘干10 h，再在105℃的条件下烘干4 h至恒重，称重，重复3次，取平均数即为该品种的干率。取烘干的薯干在研钵中研磨，用80目的筛子过筛，取干粉0.3 g（精确至0.001 g），加入20 mL的提取液，摇匀，再用提取液定容至50 mL，静置2 h以上，取1 mL上清液于250 mL锥形瓶，加入100 mL 1 %盐酸溶液，置于安装好的微波炉中消解70 s，冷却后，取澄清滤液进行下一步试验。
1.3 花青素可见分光光度法测定原理
1.3.1 对照品溶液的制备
常温下，精密称取原花青素对照品0.01 g，加入甲醇溶液，定容于10 mL，摇匀，得到1 mg/mL对照品溶液。
1.3.2 供试品溶液的制备
准确称取样品0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加入35 mL甲醇，微波处理70 s，冷却至室温，加入甲醇至刻度定容，摇匀，静置至澄清后，取上清液备用。
1.3.3 最大吸收波长
精确量取一定量紫甘薯提取液，用酸性甲醇溶液稀释至一定体积，使其吸光值在一定范围内，在400nm～600 nm波长范围内进行可见光的扫描，绘制吸收光谱图曲线，测定最大吸收波长为520 nm。
2.1 标准曲线的绘制
精确吸取2、4、6、8、10mL标准品储备液（1mg/mL），转移至100 mL容量瓶中，加入一定量的显色剂，用1 %盐酸甲醇溶液稀释并且定容至刻度，在520 nm下测定吸光度，测定标准曲线见图1。
以吸光度（A）对浓度（C）进行线性回归，得回归方程为：A=0.0986C（C为测试溶液的浓度，单位μg/mL），r = 0.999 5（n = 5），该标准曲线在浓度为1.8 μg/mL～8.2 μg/mL的范围内线性良好。
图1 标准曲线的测定
Fig.1 Determination of standard curve
2.2 样品的测定
精确吸取10 mL样品溶液（1 mg/mL），于100 mL容量瓶中，加入一定量的显色剂，用1 %盐酸甲醇溶液稀释，并且定容至刻度，按照标准曲线的测定方法，以同批1 %盐酸甲醇溶液代替试样溶液作空白对照，置520 nm处，平行6次，测定其吸收度，由标准曲线求得试样中花青素的含量，结果见表1。
表1 样品的测定结果
Table 1 The measurement results of the samples
试样 花青素含量/（mg/g） 均值/（mg/g） 相对标准误差/% 1 1.984 2 2.011 3 1.978 2.018 5.26 4 1.964 5 2.115 6 2.056
3.1 紫甘薯中花青素提取条件
3.1.1 提取溶剂的选择
准确量取紫甘薯提取液1 mL，共4份，分别置于100 mL容量瓶中，分别加入甲醇、95 %乙醇、1 %盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL和1 %盐酸乙醇溶液（体积分数）各50 mL，定容至100 mL，浸提8 h。分别取1 mL，按照2.1项配制方法测量其吸光度。最后确定1 %的盐酸甲醇溶液作为提取溶剂。
3.1.2 提取溶液盐酸用量的选择
准确量取紫甘薯提取液1 mL，共5份，分别置于100 mL容量瓶中，分别加入甲醇50 mL、0.5 %盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL、1 %盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL、1.5 %盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL和2 %盐酸甲醇溶液（体积分数）50 mL，定容至100 mL，浸提8 h。分别取1 mL，按照2.1项配制方法测量其吸光度。最后确定提取溶液盐酸浓度为1 %。
3.1.3 紫甘薯中花青素提取时间的选择
准确量取紫甘薯提取液1 mL，共6份，分别置于100 mL容量瓶中，分别加入1 %盐酸甲醇50 mL于6份样品，定容至100 mL，密封状态下进行提取，提取时间分别为1、2、4、6、8、10 h。分别取1 mL，然后按照2.1项配制方法进行样品制备，测量其吸光度。最后确定浸提时间为8 h。
3.1.4 紫甘薯中花青素提取温度的选择
准确量取紫甘薯提取液1mL，共5份，分别置于100 mL容量瓶中，分别加入1 %盐酸甲醇50 mL，定容至100 mL，分别在40、50、60、70、80℃条件下提取。分别取滤液1 mL，然后按照2.1项配制方法进行样品制备，测量其吸光度，最后提取温度确定为60℃。
3.1.5 紫甘薯中花青素提取料液比的选择
准确量取紫甘薯提取液1 mL，共5份，分别置于100 mL容量瓶中，分别加入1 %盐酸甲醇50 mL，定容至100 mL，分别选取料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 和1∶30（体积比）条件下提取。分别取1 mL，然后按照2.1项配制方法进行样品制备，测量其吸光度。最后提取料液比确定为1∶20（体积比）。
3.1.6 紫甘薯中花青素提取微波时间的选择
微波处理时间加长，加速了紫甘薯中原花青素的浸提，但是随着时间的增加，微波的高效加热使提取剂温度迅速接近易使花青素分解的温度（70℃～80℃）。目前花青素的各种提取方法[7]，提取温度均控制在70℃以下，微波处理70 s后提取液温度略高于70℃，超过70 s糊化现象出现机率很高[8]，使提取剂和废渣难以通过抽滤分离，浸提量反而下降，这可能是随着微波处理时间的延长，使料液温度增高，低聚原花青素被破坏，因此，确定微波处理时间为70 s。
3.2 回收试验[9]
从上述供试品的提取液中准确量取40 mL溶液至真空干燥箱于50℃下烘干，得紫甘薯花青素干粉，将其平均分为两份。准确量取提取液20 mL两份，分别加入上述所得紫甘薯花青素干粉，按照标准曲线的测定方法，以同批1 %盐酸甲醇溶液代替试样溶液作空白对照，置520 nm处测定其吸收度，由标准曲线求得试样中花青素的含量。测定结果和回收率见表2。
3.3 重现性试验[10]
精确称取同一批次的样品6份，每份0.5 g，分别置50 mL容量瓶中，按2.1项配制方法制备供试溶液，依次操作。
得到结果：93.331 8、93.310 9、91.421 8、91.327 6、92.351 7、92.409 5，得均值92.358 9，RSD为1.945 %，表明方法重现性良好。
表2 回收试验结果
Table 2 Recovery test results
加标量/ （mg/g）测得量/ （mg/g） 回收率/%平均回收率/% RSD/% 3.576 3.485 97.5 3.581 3.504 97.8 97.8 2.08 3.584 3.519 98.0
3.4 最低检出限[11]
以扣除空白值后的吸光值为0.01相对应的浓度值为检测限，计算最低检出限为8.35 μg，以溶液总体积为10 mL计算最低检测浓度为0.835 μg/mL。
用酸性甲醇溶液对紫甘薯进行消解提取，并用微波辅助提取，可见分光光度法对紫甘薯中的花青素含量进行测定[11]。在提取溶剂1 %盐酸甲醇溶液（体积分数）、盐酸浓度为1%、浸提时间为8h、提取温度为60℃、提取料液比为1∶20（体积比）、微波处理时间为70 s情况下，测定结果表明，结果表明：花青素线性范围1.8 μg/mL～8.2 μg/mL，相对标准偏差为5.26 %（n=6），加标平均回收率为97.8 %，最低检测浓度为0.835 μg/ mL。该方法简便准确，可用于紫甘薯中花青素含量的测定。
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Determination of Anthocyanins in Purple Sweet Potato by Microwave Digestion and Visible Spectrophotometric
Abstract：This article discuses the microwave-assisted extraction of anthocyanin from purple sweet potato and the way to quantitatively detect anthocyanin under visible spectrophotometer measure system. The result demonstrates that the determination of absrbance of anthocyanins in the sample at the 520 nm，the relative standard deviation is 5.26 %（n=6），average recovery at the spiked level is 97.8 %，the minimum detectable concentration of anthocyanin is 0.835 μg/mL. The present invention provides a quick easy way to quantitatively detect anthocyanin in purple sweet potatoes.
Key words：purple sweet potato；anthocyanins；microwave digestion；visible spectrophotometric
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.039
收稿日期：2014-11-07