表1 2012年餐（饮）具大肠菌群检出结果
Table 1 In 2012 the public tableware（drinkware）with coliforms detect results
次数 检测份数 阳性数 阳性率/% 合格率/% 1 65 5 7.7 92.3 2 65 6 9.2 90.8 3 65 5 7.7 92.3 4 65 0 0.0 100 5 70 4 5.7 94.3 6 70 2 2.9 97.1合计 400 22 5.5 94.5
摘 要：对公共餐（饮）具中大肠菌群污染状况进行检测分析，并对大肠菌群阳性菌进行鉴定分型。结果显示：2012年、2013年检测的本单位公共餐（饮）具合格率分别为94.5 %、98.6 %，餐具消毒合格率符合国家卫生标准；从大肠菌群阳性结果中得到28株大肠菌群阳性菌，并对其菌类分型，共检出肺炎克雷伯菌14株，占50 %；阴沟肠杆菌7株，占25.0 %；弗劳地柠檬酸杆菌5株，占17.9 %；大肠埃希菌2株，占7.1 %，而肺炎克雷伯菌是公共餐（饮）具大肠菌群污染的主要型别。因此必须严格餐（饮）具消毒，预防食源性疾病的发生。
关键词：餐饮具；微生物污染；大肠菌群；鉴定分型；食源性疾病
微生物污染所引起的食源性疾病作为一个严重的公共卫生问题已引起人们的关注和研究。餐（饮）具接触直接入口食品，致病微生物可通过被污染的餐（饮）具进入人体，引起食物中毒或传染病等。防止食源性传染病的传播，保障餐者的健康已成为各级学校和食品卫生监督机构责无旁贷的任务。
加强餐（饮）具消毒和检测是餐饮卫生管理工作中的重要环节，大肠菌群则是国家规定餐具检测的必检项目[1]。常有餐（饮）具被大肠菌群污染的报道，但污染餐（饮）具的大肠菌群主要型别报道较少，本课题对检出的大肠菌群阳性菌进行了鉴定分型，得出被污染的餐（饮）具中主要的大肠菌群有：大肠埃希菌（E. coli）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freumdii）、克雷伯氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae）和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）。它们是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。因此通过对检出的大肠菌群进行分型鉴定，为公共餐（饮）具进行系统卫生监测提供科学依据，并进行针对性的预防及控制。
1.1 材料
1.1.1 样品来源
本单位10个公共食堂的清洗消毒后的各类餐具（碗、盘、筷子、汤勺等），随机抽取，每年检测6次。1.1.2培养基及其它
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）：北京奥博星生物技术有限责任公司；肉汤琼脂培养基、麦康凯琼脂（MacConkey）、伊红美蓝琼脂（EMB）：北京陆桥技术有限责任公司；大肠杆菌O抗原血清：天津生物芯片技术有限责任公司；生理盐水，装于三角瓶，121℃灭菌20 min；检测纸片（自制），定性滤纸，每张面积为2.5 cm×2 cm，干热灭菌2 h～3 h。1.1.3仪器
CX31-72C02数码摄影生物显微镜：奥林巴斯（中国）有限公司（OCN）；BSP-250生化培养箱：上海博迅实业有限公司；DSX-280B手提式自动压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械有限公司；59KHZ超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份公司；百得（BIOHIT）移液器：芬兰；BGZ-240电热干燥箱：上海博迅实业有限公司；SW-CJ-1A水平流超净工作台：苏州净化设备厂。1.2方法
1.2.1 采集样品
根据参考文献[2]GB14934-94《食（饮）具消毒卫生标准》方法，在现场随机抽取清洗消毒后的各类餐具（碗、盘、筷子、汤勺等）。碗、盘、杯以2件～5件为1份样品，筷子以10支为1份样品，用无菌生理盐水湿润检测纸片后，贴于餐具内侧表面，每件贴纸片2张～5张，1 min后依粘贴顺序取下，置于无菌生理盐水内悬摇，制成原液供检。
1.2.2 检验
1.2.2.1 发酵法检验
按照参考文献[3]GB 4789. 3- 2010《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群计数》的方法进行发酵法检验，于37℃培养24 h～48 h。
1.2.2.2 判定标准
以大肠菌群是否检出，判断其消毒是否合格，即：大肠菌群指标阴性视为消毒合格，阳性视为消毒不合格。
1.2.2.3 鉴定方法
细菌的生理生化实验（IMVIC）；血清学实验[4]。
2.1 大肠菌群的检测
按照方法1.2.1、1.2.2，餐（饮）具包括：碗、碟、盘子、筷子等，以2012、2013年食堂餐（饮）具每年检测6次计，各食堂餐具大肠菌群检出情况见表1、表2。
表1 2012年餐（饮）具大肠菌群检出结果
Table 1 In 2012 the public tableware（drinkware）with coliforms detect results
次数 检测份数 阳性数 阳性率/% 合格率/% 1 65 5 7.7 92.3 2 65 6 9.2 90.8 3 65 5 7.7 92.3 4 65 0 0.0 100 5 70 4 5.7 94.3 6 70 2 2.9 97.1合计 400 22 5.5 94.5
表2 2013年餐（饮）具大肠菌群检出结果
Table 2 In 2013 the public tableware（drinkware）with coliforms detect results
次数 检测份数 阳性数 阳性率/% 合格率/% 1 70 2 2.9 97.1 2 70 1 1.4 98.6 3 70 0 0 100 4 70 1 1.4 98.6 5 70 1 1.4 98.6 6 70 1 1.4 98.6合计 420 6 1.4 98.6
结果显示：2012年餐（饮）具消毒合格率为94.5 %，2013年餐（饮）具消毒合格率为98.6 %，餐（饮）具消毒合格率符合国家卫生标准，且逐年上升。
2.2 菌类分型
将2.1各批次餐饮具中检出的大肠菌群阳性菌，保存于营养琼脂斜面培养基中共计28株，根据其在不同培养基中培养得到的可疑菌落，通过形态观察、生理生化实验及血清学反应，进行菌类鉴定及分型。
2.2.1 菌落形态
将2.1各批次餐饮具检出的大肠菌群阳性菌，分别采用细菌常用的培养基，营养琼脂、肉汤琼脂、伊红-美蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂（MacConkey）划线分离出单个菌落，共检出4类菌落形态分别记为1#、2#、3#、4#结果见表3和图1、图2、图3、图4。
表3 显示了检出大肠菌群的阳性菌中有4种菌落形态及特征出现，说明阳性菌中至少有4种分型。
2.2.2 生理生化鉴定
细菌在新陈代谢过程中进行着各种生物化学反应，由于细菌所具有的酶系不尽相同，对底物的分解能力也不一样，因而其代谢产物也不同。用生物化学方法检测这些代谢产物，可帮助鉴定细菌，通过观察细菌在是否产生某种特殊的代谢产物，来判断细菌的生化反应结果，用于肠杆菌科细菌的鉴别[5]。确定检出的大肠菌群需要进行的生理生化实验为：糖（醇、苷）类发酵试验、吲哚试验（I）、甲基红试验（MR）、伏普（VP）、柠檬酸盐试验（C）、硫化氢试验（H2S）。
表3 大肠菌群在不同培养基中的菌落特征及个体形态
Table 3 Coliforms colony characteristic and individual form in different medium
菌类 1# 2# 3# 4#培养基 伊红-美蓝琼脂（EMB） 肉汤琼脂 肉汤琼脂 麦康凯琼脂（MacConkey）菌落特征及形状颜色：粉红色或红色。在伊红-美蓝琼脂上为粉红色形状：形成大而湿润的黏液状菌落。状态：呈黏稠状染色及镜检颜色：紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，有金属光泽形状：圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润颜色：灰色，表面有光泽形状：光滑、低凸、湿润、半透明或不透明边缘不整齐状态：偶尔可见粘液或粗糙型颜色：灰白色有闪光形状：形成较大灰白色粘液菌落状态：粘韧度不等，以接种环挑起，易拉成丝革兰氏阴性杆菌，无芽胞 革兰氏阴性杆菌，无芽胞，单个和成对革兰氏阴性杆菌，无芽胞，稍呈圆形、粗短杆，单独、成双或短链状排列。无鞭毛、有荚膜革兰氏阴性杆菌，无芽孢，短粗杆菌
图1 1#革兰氏染色图片
Fig.1 1# Gram staining images
图2 2#革兰氏染色图片
Fig.2 2# Gram staining images
图3 3#革兰氏染色图片
Fig.3 3# Gram staining images
图4 4#革兰氏染色图片
Fig.4 4# Gram staining images
根据2.2.1菌落特征，涂片染色的菌形及染色反应，对检出的大肠菌群分别取纯培养物进行经典的细菌生理生化实验，实验结果如表4。
表4 大肠菌群生理生化实验结果
Table 4 Coliform bacteria physiological and biochemical experiment results
注：+为结果为阳性；-为结果为阴性。
试验项目 1# 2# 3# 4#糖（醇、苷）类发酵试验 产酸产气产酸产气吲哚试验（I） + - - -甲基红试验（MR） + + - -伏普试验（V-P） - - + +柠檬酸盐试验（C） - + + +硫化氢试验（H2S） - + - +产酸产气产酸产气
根据卫生防疫细菌检验方法，通过生理生化实验初步鉴定：
1）凡符合吲哚试验阳性、甲基红试验阳性、V-P试验阴性、柠檬酸盐（C）试验阴性，即（IMViC + + - -）；硫化氢（H2S）试验阴性结果的，判定1#为典型的大肠杆菌，表明被检物已有粪便污染，有传播肠道传染病的危险。
2）凡符合能利用柠檬酸盐作为惟一碳源，吲哚试验阴性、甲基红试验阳性、V-P试验阳性，即（IMViC - + + +）；硫化氢（H2S）试验阳性结果的，判定2#为费氏柠檬酸杆菌，表明被检物已有粪便污染，为条件致病菌。
3）凡符合吲哚试验阴性、甲基红试验阴性、V-P试验阳性、柠檬酸盐（C）试验阳性，即（IMViC--++）；硫化氢（H2S）试验阴性结果的，判定3#为肺炎克雷伯氏菌。
4）凡符合吲哚试验阴性、甲基红试验阴性、V-P试验阳性、柠檬酸盐（C）试验阳性，即（IMViC - - + +）；硫化氢（H2S）试验阳性结果的，判定4#为阴沟肠杆菌。
2.2.3血清学实验
生化鉴定是主要的鉴定依据，由于抗原和抗体都具有特异性，故可用已知抗血清，通过血清学凝集反应来鉴别未知细菌。
在洁净玻片上用接种环取两滴彼此分离的生理盐水；从肉汤琼脂平板上挑取分纯的菌落，分别与玻片上的生理盐水混匀；用接种环滴加1滴～2滴血清（10 μL～15 μL）于玻片上，用接种环分别混匀玻片上的两种混合液，轻轻摇动玻片1 min，观察。于1 min内呈2+及以上凝集现象为阳性，1 min内呈现2+以下凝集现象为阴性，凝集实验结果如表5。
表5 大肠菌群凝集实验结果
Table 5 Coliforms agglutinate experiment results
注：1+、2+、3+、4+为反应强度，是凝集实验判别依据。
项目 1# 2# 3# 4#反应强度 2+：反应有3+：与O血清发生凝集反应4+ 反应澄清透明，凝集颗粒较多、较大3+ 反应澄清透明，凝集颗粒较多、较小2+ 反应有些混浊，但仍可见较多颗粒状凝集1+ 反应非常混浊，只有少许颗粒状凝集-反应完全混浊，未出现任何凝集些混浊，但仍可见较多颗粒状凝集2+：反应有些混浊，但仍可见较多颗粒状凝集1+：反应非常混浊，只有少许颗粒状凝集
由表5可知：玻片凝集试验是测定大肠菌群的常规方法，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。
1）餐（饮）具中检出的大肠菌群阳性菌中有4种菌落形态及特征出现，根据生理生化鉴定及血清学反应，对检出的大肠菌群阳性菌进行鉴定分型，初步得出大肠菌群常见的型别有：大肠埃希菌、弗劳地柠檬酸杆菌（Citrobacter freumdii）、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌。它们并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，可以确定表明被检物已有粪便污染，有传播肠道传染病的危险。对于餐（饮）具中检出的大肠菌群鉴定分型的深入研究，采用分子生物学的鉴定方法后续进行中。
2）2012 年～2013年单位食堂餐具大肠菌群合格率呈上升趋势，平均合格率为96.5 %，达到合格率在90 %以上的要求，符合国家卫生标准。大肠菌群作为检测食品和饮用水是否被粪便污染，即是否被致病菌污染，食后对人体健康造成危害的可能性大小的重要卫生指标。发酵法是目前检测大肠菌群的经典国标方法，它更能反映结果的准确性。
3）餐具直接接触入口食品，致病微生物可通过被污染的餐具进入人体，引起食物中毒或传染病等。餐具消毒效果的监测是食品卫生监督管理的主要内容之一，也是预防餐具不洁造成食源性疾病的重要措施。说明随着近几年推行食品卫生监督量化分级管理，使管理者的卫生意识逐渐增强，餐具的卫生状况明显的提高。
4）建议：虽然学校餐具消毒合格率比较高，但是餐具消毒工作必须持之以恒；餐具洗消人员严格执行一刷、二洗、三清、四消毒、五保洁的制度，保证消毒时间，定期或不定期进行餐具消毒效果监测；定期组织学校食堂从业人员进行卫生知识、法规知识培训，提高他们的守法意识和卫生知识水平，把好食品卫生和餐具消毒关；配备合格的餐具消毒和保洁设备，切实保证餐具清洗、消毒和保洁3个工作程序的落实，以保证用餐者的饮食卫生安全。
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Coliforms Pollution Situation in the Public Tableware（Drinkware）and the Type Classification Results
Abstract：To understand the pollution situation of all type of coliform bacteria in the public tableware （drinkware）and type classification. The situation of coliform bacteria pollution to provide scientific basis for taking effective measures to prevent the pollution in tableware（drinkware）. Results showed that in 2012，2013，public tableware（drinkware）detected，with a qualification rate of 94.5 %，98.6 %，tableware disinfection qualified rate in line with national health standards；In 28 strains of coliform bacteria，14 strains of klebsiella pneumoniae were detected，accounting for 50 %；Sewer enterobacter 7 strains，25.0 %；Frau Dietrich Citrobacter 5 strains，17.9 %；Escherichia coli 2 strains，7.1 %，and klebsiella pneumoniae was the main cause of public tableware（drinkware）contamination. So must be strictly food（drink）with disinfection，prevent the occurrence of food poisoning and infectious diseases.
Key words：public tableware；microbial contamination；coliforms；bacterial classification；foodborne diseases
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.036
基金项目：天津科技大学大学生实验室创新基金资助课题（1404A103）
收稿日期：2014-11-23