不同冲泡方式普洱茶提取液UPLC指纹图谱方法研究

吴娜1，2，苟高章1，2，徐世娟1，2，周波1，2，陈显兰1，2，刘卫1，2，*
（1.红河学院理学院，云南蒙自661199；2.云南省高校“地方特色资源利用与新材料”重点实验室，云南蒙自661199）

摘　要：考察浸泡时间、浸泡温度、浸泡次数以及拆封储藏时间对普洱茶的水提取液中目标成分（咖啡碱、茶多酚、没食子酸）的影响，建立普洱茶不同冲泡条件下水提取液UPLC指纹图谱，并与普通茶叶进行图谱和目标成分相对峰面积的比较，同时采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）版》软件对其指纹图谱进行相似度评价。试验优化结果为：普洱茶水提取液中主要成分的提取条件是采用25 mL 90℃纯净水冲泡，冲泡2次，每次冲泡时间为5 min，拆封储藏2周为宜。

随着普洱茶的热潮高涨，越来越多的学者开始对其研究，将指纹图谱技术用于许多茶叶化学成分的定性和定量分析中[1]。茶叶化学指纹图谱的建立，有利于对茶的质量进行评估，能够辨别不同地区茶叶的真伪，实现茶叶的现代化。把茶叶化学指纹图谱技术用于普洱茶主要化学成分变化规律的研究，能使结果更准确、更丰富、更全面。获取茶叶指纹图谱的方法主要有薄层色谱法（TLC、TLCS）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、高效毛细管电泳法（HPCE）、联用技术、红外光谱法（IR）等[2]。高效液相色谱（HPLC）法以经典液相色谱法为基础，引入GC理论和分离分析方法，它只要求样品能制成溶液，具有适用范围广、灵敏度高、选择性强、样品用量少、分离性能好、分析速度快等优点，越来越被用于茶叶分离、分析的研究当中，茶叶HPLC指纹图谱是指茶叶经过适当处理后，通过采用HPLC技术，得到的能够标示该类茶叶特性的共有峰[3]，非常适合构建茶叶指纹图谱。超高效液相色谱（UPLC）技术用于指纹图谱研究，具有较高的灵敏度及响应值，与普通液相色谱（HPLC）有很大差异[4-6]。

近年来，随着茶叶产业的迅速发展和指纹图谱在茶叶中的有效利用，相似系统理论在茶叶化学指纹图谱的建立中得到认可，被用于茶叶质量评价及其控制。相似度是样品指纹图谱与对照样品指纹图谱共有模式相似性的量度，相似度评价是掌握运用指纹图谱所提供信息的常见方法，而且已经有多种相似度的计算方法被用于指纹图谱的研究中，常使用中南大学和浙江大学开发的指纹图谱相似度计算软件[7]。样品的相对差异可从相似度的计算结果中反映出来，从而可得出样品成分的变化规律和控制中药的质量。为了从指纹图谱提供的信息中得出不同冲泡方式对普洱茶品质成分的影响，论文使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）版》软件计算所得普洱茶指纹图谱的相似度，观察结果中样品的相对差异，得到普洱茶品质成分的变化规律。

国内外对普洱茶的研究主要集中在普洱茶汤及其茶多酚、茶色素等成分降血糖的研究、化学成分的主要功能以及某一药理动物模型研究方面。如日本学者I?Tomita通过用中国云南生产的普洱茶和日本绿茶进行动物实验，发现连续喂养普洱茶可以促进脂肪组织中三酸甘脂分解[8]；法国国立健康和医学研究所80年代以来的临床实验表明，普洱沱茶可降血脂[8]；张铭光等报道过利用热脱附一裂解色谱对普洱茶指纹图谱进行的聚类分析研究[9]；王丽鸳等利用针对茶多酚类、咖啡碱及黄酮（苷）类物质含量变化的两个HPLC色谱，制作了滇青（晒青毛茶）、青饼和普洱茶熟饼的化学指纹图谱，并进行了初步的分析与判别研究[10]。但是这些研究中利用UPLC技术对普洱茶在不同冲泡条件下成分变化规律研究的文献报道还较少。因此，论文在普洱茶主要化学成分（没食子酸、咖啡碱、茶多酚等）的基础上，借鉴UPLC技术在中药指纹图谱中的应用，对普洱茶系列不同冲泡方式的提取液建立UPLC指纹图谱，采用相似度理论进行评价，从而得到普洱茶提取液品质成分的变化规律，为消费者科学饮茶提供理论参考。

1　材料与方法

1.1　仪器及试剂

Nexera超高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器：日本岛津；C8柱（VenusilXBP C8，5 μm，3.9 mm× 150 mm）：安捷伦；HS-3120超声波清洗器：北京恒奥德仪器仪表有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵：天津华鑫仪器厂；A型双层铁皮电炉：上海电航五金电器厂丹阳分厂。

乙腈（GR）、甲醇（GR）：TEDIA，USA；无水乙醇（AR）、正己烷（AR）、50 %乙醇（AR）、60 %乙醇（AR）：天津市风船化学试剂科技有限公司；乙酸乙酯（AR）：广东光华科技股份有限公司；无水硫酸钠（AR）：汕头市西陇化工有限公司；纯净水。

1.2　标准品及其配制

没食子酸（Gallic acid批号GZDD-0128），咖啡碱（普通茶叶中提取[11]）、茶多酚主要成分（普通茶叶中提取[12]），取咖啡碱、茶多酚、没食子酸适量，加甲醇制成30 μg/mL的对照品溶液。

普通茶叶：购于云南蒙自五里冲茶厂，普洱茶（大益牌7542），将茶叶用研钵粉碎放于密闭容器中。

1.4　超高效液相色谱检测条件

流动相：A相为纯净水，B相为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱（5 %～100 %乙腈）；流速1 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：5 μL；总运行时间：50 min。1.5方法

水提取液的制备：每份样品称取0.5 g普洱茶粉末，于具塞锥形瓶中，加入25 mL沸水恒温浸泡10 min，冲泡2次的混合液，趁热过滤，滤液过0.45 μm滤膜于进样瓶中为供试液；每份样品称取0.5 g普洱茶粉末，于具塞锥形瓶中，加入50 mL 60 %乙醇，超声提取30 min，抽滤，滤液浓缩并过0.45 μm滤膜于进样瓶中为供试液；将上述所得供试液于高效液相色谱仪进样，建立UPLC指纹图谱。

2　结果与分析

2.1　普洱茶不同冲泡温度水提取液的UPLC指纹图谱

称取4份0.5 g普洱茶粉末于具塞锥形瓶中，分别加25 mL 50、70、90、96℃（沸水）恒温浸泡10 min，趁热过滤，滤液分别过0.45 μm滤膜于进样瓶中，待测。在1.4的色谱条件下进样，同时选取3个目标物（没食子酸、咖啡碱、茶多酚）在同等条件下进样，得普洱茶不同冲泡温度的提取液与目标物的UPLC对照指纹图谱，见图1。

对选取的目标物相对峰面积进行比较，90℃前随着温度的升高，各相对峰面积逐渐增加，到96℃（沸水温度）时，目标物相对峰面积有下降趋势，因此，普洱茶的最佳冲泡温度为90℃。采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004（A）版对4个温度下普洱茶水提取液的UPLC指纹图谱进行相似度分析。选用目标物图谱作对参照图谱，采用相关系数作为测度，计算所有样品的相似度，见表1。

由表1相似度的计算结果可知，普洱茶在4个不同冲泡温度下的样品与对照指纹图谱的相似度都在0.98以上，说明普洱茶在4个不同冲泡温度下的UPLC指纹图谱与对照图谱相似度高。

2.2　普洱茶不同冲泡时间水提取液的UPLC指纹图谱

称取4份0.5 g普洱茶粉末置于具塞锥形瓶中，分别加25 mL 90℃纯净水恒温浸泡6、10、20、30 min，趁热过滤，滤液分别过0.45 μm滤膜于进样瓶中，待测。在1.4的色谱条件下进样，同时选取3个目标物（没食子酸、咖啡碱、茶多酚）在同等条件下进样，得普洱茶不同冲泡时间的提取液与目标物的UPLC对照指纹图谱，见图2。

对选取的目标物相对峰面积进行比较，没食子酸的相对峰面积随冲泡时间的增加无较大变化，咖啡碱、茶多酚的相对峰面积在10 min后增加比较缓慢，因此，普洱茶的冲泡时间在10 min左右为宜。采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004（A）版对不同冲泡时间下普洱茶水提取液的UPLC指纹图谱进行相似度分析。选用目标物图谱作为对照图谱，采用相关系数作为测度，计算所有样品的相似度，见表2。

由表2的相似度计算结果可知，普洱茶在4个不同冲泡时间下的样品与对照指纹图谱的相似度都在0.84以上，表明普洱茶在4个不同冲泡时间下的UPLC指纹图谱与对照图谱相似度较高。

2.3　普洱茶不同冲泡次数水提取液的UPLC指纹图谱

称取4份0.5 g普洱茶粉末置于具塞锥形瓶中，加25 mL 90℃纯净水恒温浸泡4次，每次泡5 min，趁热过滤，滤液分别过0.45 μm滤膜于进样瓶中，待测。在1.4的色谱条件下进样，同时选取3个目标物（没食子酸、咖啡碱、茶多酚）在同等条件下进样，得普洱茶不同冲泡次数的提取液与目标物的UPLC对照指纹图谱，见图3。

对选取的目标物相对峰面积进行比较，没食子酸、咖啡碱、茶多酚的相对峰面积随着冲泡次数的增加逐渐降低，第2次后各目标物相对峰面积显著减少，因此，普洱茶的冲泡2次为宜。采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004（A）版对不同冲泡次数下普洱茶水提取液的UPLC指纹图谱进行相似度分析。选用目标物图谱作为对照图谱，采用相关系数作为测度，计算所有样品的相似度，见表3。

由表3的相似度计算结果可知，普洱茶在4次不同冲泡次数下的样品与对照指纹图谱的相似度都在0.72以上，但低于0.8，表明普洱茶在4次不同冲泡次数下的UPLC指纹图谱与对照图谱相似度有较大差异。

2.4　储藏时间对普洱茶水提取液UPLC指纹图谱的影响

将普洱茶茶饼撬开放于密闭容器中，常温放置1周、2周、3个月，在1.5条件下制取放置不同时间的水提取液样品，于1.4的色谱条件下进样检测，建立普洱茶储藏不同时间的UPLC指纹图谱，见图4。

对该指纹图谱进行相似度分析，相似度均在0.96以上，见表4。

表明普洱茶在4个不同储藏时间下的UPLC指纹图谱相似度较高；另外，通过对目标物相对峰面积的数据变化比对，可知在3个月内茶多酚相对峰面积无明显变化，没食子酸、咖啡碱的相对峰面积在储藏两星期以前变化不大，但3个月时相对峰面积明显减少。因此，建议普洱茶拆封密封储藏两星期左右为宜。

2.5　普洱茶与普通茶水提取液指纹图谱对比

在1.5的条件下，制取普洱茶和普通茶水提取物于1.4的色谱条件下进样，对其图谱进行比较，见图5。

由图中可看出区别不大，但对谱图中目标物相对峰面积进行分析，结果见表5。

由表可知，普通茶中没食子酸、咖啡碱、茶多酚的相对峰面积要比普洱茶中的大，说明不同茶叶的主要成分含量是有区别的。

3　　结论

本文将超高效液相色谱技术与指纹图谱技术结合，通过考察不同浸泡时间、浸泡温度、浸泡次数以及拆封储藏时间对普洱茶水提取液指纹图谱和目标成分（咖啡碱、茶多酚、没食子酸）的影响，初步建立了普洱茶不同冲泡方式的水提取液UPLC指纹图谱分析方法，并采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）版》软件对其指纹图谱进行分析，相似度均较高，整体有效地表征了普洱茶在不同冲泡条件下水提取液主要成分变化情况，为科学饮茶提供参考。结果表明，拆封储藏2周内的普洱茶采用25 mL 90℃纯净水冲泡，每次冲泡5 min并冲泡2次，其水溶液中有效成分较好。通过与普通茶叶进行图谱和目标成分相对峰面积的比较，客观地说明普洱茶与普通茶叶是有区别的。

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Study on the Method of UPLC Fingerprint about Extract of Pu-erh Tea with Different Infusing Methods

WU Na1，2，GOU Gao-zhang1，2，XU Shi-juan1，2，ZHOU Bo1，2，CHEN Xian-lan1，2，LIU Wei1，2，*
（1. College of Science，Honghe University，Mengzi 661199，Yunnan，China；2. Local Characteristic Resource Utilization and New Materials Key Laboratory of Universities in Yunnan，Mengzi 661199，Yunnan，China）

Abstract：The effects of soaking time，soaking temperature，number of time of soaking as well as storage time on the major ingredient in aqueous extracts of Pu-erh tea were studied. The UPLC fingerprint of aqueous extracts for Pu-erh tea was established and compared with spectrogram and relative peak area of the target in the aqueous extracts of ordinary tea，analyzed by the traditional chinese medicine（TCM）chromatographic fingerprint similarity evaluation system（A）2004 edition software. Under the condition of optimization，the best extraction conditions include that the major ingredient in extracts of Pu-erh tea were brewed with 90℃water （25 mL）about 5 minutes and twice. Once opened，it was advisable to store 2 weeks for Pu-erh tea.

Key words：Pu-erh tea；aqueous extract；the ultra-high performance liquid chromatography；fingerprint

基金项目：云南省应用基础研究计划青年项目（2012FD053）；云南省应用基础研究计划自筹项目（2013FZ121）

作者简介：吴娜（1985—），女（彝），讲师，硕士，从事中药材与食品中农药残留检测分析及中药材指纹图谱分析。

*通信作者：刘卫（1962—），教授，从事食品药品农药残留检测分析及光催化。

不同冲泡方式普洱茶提取液UPLC指纹图谱方法研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

1　材料与方法

2　结果与分析

3　　结论