图1 PAHs（400 ng/mL）的全扫色谱图
Fig.1 The full scan chromatogram of PAHs（400 ng/mL）
摘 要：建立了测定食用槟榔中15种多环芳烃（PAHs）的气相色谱－质谱（GC－MS）的方法。样品经正己烷超声萃取后，采用凝胶渗透色谱（GPC）和分散固相萃取（DSPE）进行净化，用气相色谱－质谱（GC－MS）测定。在优化条件下，采用外标法测定，被测目标在线性范围内其相关系数（r2）不低于0.996，检出限为0.2 ng/mL～1.0 ng/mL；精密度（RSD，n= 7）不大于4.38 %，回收率试验结果满意。该方法用于食用槟榔中多环芳烃的测定是可行的。
关键词：食用槟榔；多环芳烃；凝胶渗透色谱；分散固相萃取；气相色谱－质谱
*通信作者
多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）是指由两个或两个以上苯环以线状，角状或簇状排列的稠环化合物，具有致癌、致畸、致突变等危害[1]；是环境中普遍存在的污染物，美国环境保护总署（EPA）将其中16种PAHs列入优先控制污染物名单[2-3]；食品在种植、养殖等环节，特别是加工过程中如烟熏、烧烤、煎炸等会产生PAHs[4]。食用槟榔是以槟榔幼果和近成熟的槟榔果经水煮、烘烤等类似工序加工成的槟榔干果为主要原料，经炮制，切片、点卤干燥等主要工序加工制作，一些槟榔干果的加工方法是通过烟熏或烘烤来实现的，这些槟榔干果就可能会含有PAHs[5-7]。目前测定食品中PAHs的方法主要有荧光分光光度法[8]，高效液相色谱法（HPLC）[9]，气相色谱－质谱法（GC－MS）[7，10-12]等，样品的净化方法通常有固相萃取（SPE）[7]、分散固相萃取（DSPE）[1-2]和凝胶渗透色谱（GPC）[11]等。食用槟榔中PAHs的测定方法鲜有报道，本文通过GPC和DSPE对样品进行净化处理，建立了GC－MS测定食用槟榔中PAHs的方法。该方法的建立为提高食用槟榔的品质及海南槟榔产业健康持续发展有重要意义。
1.1 仪器与材料
7890A－5975C气相色谱－质谱联用仪（美国Agilent公司）；自动凝胶渗透色谱仪（Lab Tech公司），色谱柱为Bio-BeadsS-X3，ID20mm×300mm，S/N：12010056，流动相：乙酸乙酯∶环己烷= 1∶1（体积比），进样环2.0mL；全自动固相萃取仪（睿科仪器有限公司）；真空旋转蒸发浓缩仪（上海豫康科教仪器公司）；DS3120超声波萃取仪（Do-Chrom）；VORTEX-2涡旋混匀器（GENIE，SCIENTIFIC INDUSTRIES INC.）；万分之一电子天平（Sartorius）；0.45μm和0.22μm有机系微孔滤膜。
PAHs混合标准溶液（o2si lot：209794，200 mg/L）；乙酸乙酯，环己烷，正己烷均为色谱纯，无水硫酸钠（分析纯国药集团）。CNWBOND固相萃取小柱（硅胶（Si），中性氧化铝（Alumina-N），乙二胺基-N-丙基（PSA））为上海安谱科学仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 标准溶液配制
PAHs混合标准贮备液浓度为200.0 mg/L，用正己烷准确稀释至20.0 mg/L。然后逐级稀释所需的浓度。
1.2.2 样品前处理
将样品去除辅料，将槟榔干果破碎成的细条状，在40℃干燥4.0 h，然后在进一步破碎为长度为2.0 mm左右用于样品分析。样品用正己烷为萃取剂，按料液比1∶10放入具塞锥形瓶进行超声波萃取，萃取时间为20.0 min。样品萃取液用0.45 μm有机膜过滤，用旋转蒸发仪浓缩并转换溶剂为凝胶渗透色谱的流动相，并定容至5.0 mL。
1.2.3 样品净化
GPC净化：将样品萃取液5.0 mL放入进样瓶，流动相为环己烷∶乙酸乙酯= 1∶1（体积比），流速为：5.0 mL/min，定量环体积为2.0 mL，收集16.5 min～32.0 min的洗脱液，30℃下用真空旋转蒸发仪浓缩并转换溶剂为正己烷，然后定容为2.5 mL。
DSPE净化：将凝胶渗透色谱净化后的萃取液经转换溶剂后，用正己烷定容2.5 mL放入装有100.0 mg的硅胶净化剂旋转混合，用0.22 μm的有机膜过滤，最后试样浓缩定容1.0 mL为上机分析用。
1.2.4 气相色谱－质谱条件
1）气相色谱条件：HP－5MS毛细管柱（30m×0.25mm ×0.25 μm），载气：He（99.999 %），流量：1.0 mL/min；进样口：280℃；不分流进样；进样体积：1.0 μL。程序升温：初始温度40℃，保持1.0 min，以10℃/min升至200℃，保持1.0 min，以5℃/min升至280℃，保持7.0 min，以10℃/min升至300℃，保持2.0 min；共计45.0 min。
2）质谱条件：离子源温度：280℃；四级杆温度150℃；电离模式：电子轰击离子源（EI）；电子能量：70 eV；溶剂延迟时间：8.0 min；数据采集模式：定性全扫模式（SCAN），定量选择离子模式（SIM）；15种PAHs的全扫色谱图和选择离子色谱图见图1和图2。15种PAHs的保留时间、特征离子、定量离子、线性方程、线性范围和相关系数参见表1。
图1 PAHs（400 ng/mL）的全扫色谱图
Fig.1 The full scan chromatogram of PAHs（400 ng/mL）
图2 PAHs（400 ng/mL）选择离子色谱图
Fig.2 The SIM chromatogram of PAHs（400 ng/mL）
表1 15种PAHs的保留时间，特征离子，定量离子，线性方程、线性范围和相关系数
Table 1 Retention time，qualitative ions，quantitative ions，linear equations，linear ranges and correlation coefficient（r2）of 15 PAHs
序号 化合物名称1 CAS登录号 出峰时间/min 定性离子（m/z）2 线性方程 线性范围/（ng/mL） 相关系数（r2）1苊烯 208-96-8 13.79 152 153 151 150 y=3622x 1.0～400.0 0.999 2 苊83-32-9 14.23 153 152 151 150 y=2859x 1.0～400.0 0.999 3 86-73-7 15.42 166 165 167 139 y=3233x 1.0～400.0 0.999 4 菲85-01-8 17.71 178 179 176 152 y=5109x 1.0～400.0 0.999 芴
续表1 15种PAHs的保留时间，特征离子，定量离子，线性方程、线性范围和相关系数
Continue table 1 Retention time，qualitative ions，quantitative ions，linear equations，linear ranges and correlation coefficient（r2）of 15 PAHs
注：1.序号与化合物以此表为准在本文中相对应；2.第一个离子为定量离子。
序号 化合物名称1 CAS登录号 出峰时间/min 定性离子（m/z）2 线性方程 线性范围/（ng/mL） 相关系数（r2）5 蒽120-12-7 17.83 178 175 179 152 y=3706x 1.0～400.0 0.999 6荧蒽 206-44-0 21.54 202 203 200 101 y=4394x 1.0～400.0 0.999 7 芘129-00-0 22.32 202 203 200 101 y=4330x 1.0～400.0 0.999 8 苯并（a）蒽 56-55-3 27.27 228 226 229 227 y=2193x 1.0～400.0 0.999 9 屈218-01-9 27.43 228 226 227 202 y=4008x 1.0～400.0 0.996 10 苯并（b）荧蒽 205-99-2 31.75 252 253 250 126 y=2293x 4.0～400.0 0.999 11 苯并（k）荧蒽 207-08-9 31.85 252 253 250 126 y=3450x 4.0～400.0 0.996 12 苯并（a）芘 50-32-8 32.94 252 253 250 126 y=1768x 4.0～400.0 0.999 13 茚并（1，2，3-cd）芘 193-39-5 37.60 276 277 138 y=1404x 4.0～400.0 0.999 14 二苯并（a，h）蒽 53-70-3 37.85 278 279 276 y=1574x 4.0～400.0 0.999 15 苯并（g，h，i）苝 191-24-2 38.82 276 277 138 y=2179x 4.0～400.0 0.998
本实验采用正己烷作为样品的萃取剂[2]。食用槟榔中基质成分复杂，既含植物原料中色素、脂肪等大分子化合物也含有食品添加剂等小分子化合物，同时还有一些极性化合物，它们的存在对样品中PAHs的测定有极大的干扰，因此采用合适的净化方法对被测化合物的分析是极为重要的。本试验采用GPC去除分子大小不在被测对象范围的杂质，然后利用DSPE去除与被测对象极性相差较大的化合物。
2.1 GPC的净化条件优化
采用GPC对提取液进行净化，根据化合物分子大小不同而达到分离净化的目的，可以使PAHs很好的与大分子化合物、色素等进行分离[14]。在Lab Tech公司提供的GPC净化食用油测定PAHs的基础上，用1.0 mg/L的浓度PAHS进样，其GPC紫外色谱图见图3所示。
图3 PAHs（1.0 μg/mL）GPC色谱图
Fig.3 The GPC chromatogram of PAHs（1.0 μg/mL）
被测物出峰时间为16.0 min左右，用50 ng/mL PAHs进样，收集31.0min～33.0min和33.0min～35.0min时间的萃取液，进行上机分析均未检测到被测物。将被测样品进样，其GPC紫外色谱图见图4所示。
图4 样品GPC色谱图
Fig.4 The GPC chromatogram of sample
样品中干扰物质也在16.0 min左右流出，因此根据上述试验结果确定收集萃取液的时间确定为16.5 min～32.0 min。经用空白加标试验（PAHs的浓度为50 ng/mL）其回收率为71.7 %～112.7 %，证实收集萃取液的时间为16.5 min～32.0 min是适宜的。
2.2 DSPE的净化条件
2.2.1 分散吸附剂的选择
本试验选择硅胶，Alumina-N和PSA作为吸附剂。取3只5.0 mL梨形蒸发瓶，分别取2.5 mL正己烷，加入PAHs的标准溶液使它们浓度为100 ng/mL，再分别加入100.0 mg的硅胶，Alumina-N和PSA，在涡旋混匀器上震荡2.0 min，然后用真空旋转蒸发浓缩仪浓缩至1.0 mL，然后上机分析。由图5可见它们对PAHs的吸附情况，其中硅胶的回收率为74.0 %～110.8 %，Alumina-N的回收率为103.0 %～150.9 %，和PSA的回收率为78.0 %～113.0 %。因此选择硅胶作为本试验的DSPE吸附剂。
图5 不同吸附剂对15种PAHs的回收率的影响
Fig.5 Effects of different dispersive sorbents on the recoveries of PAHs
2.2.2 分散吸附量的选择
DSPE中吸附剂的用量一般应适中，用量选择少则净化效果不佳，过多则对被测目标吸附过多，因此本试验选择硅胶的添加量为50.0、100.0、150.0 mg和200.0 mg进行优化。取4只5.0 mL梨形蒸发瓶，分别取2.5 mL正己烷，加入PAHs的标准溶液使它们浓度为100 ng/mL，再分别加入上述选定的硅胶的添加量，在涡旋混匀器上震荡2.0 min，然后用真空旋转蒸发浓缩仪浓缩至1.0 mL，然后上机分析。由图6可见不同添加量对PAHs的吸附情况，其中硅胶的添加量为50.0 mg的回收率为69.4 %～97.0 %，添加量为100.0 mg的回收率为74.0 %～110.8 %，添加量为150.0 mg的回收率为51.9 %～98.6 %，添加量为200.0 mg的回收率为42.6 %～87.0 %。因此选择硅胶的添加量为100.0 mg是适宜的。
图6 不同硅胶用量对15种PAHs的回收率的影响
Fig.6 Effects of different amounts of si on the recoveries of PAHs
2.3 方法的线性范围及检出限
配制适宜浓度的PAHs标准溶液，在给定的条件下测定，以15种PAHs的定量离子峰面积为纵坐标，以其对应的浓度为横坐标，进行线性回归，结果见表1。15种PAHs的线性范围为1.0 ng/mL～400.0 ng/mL 或4.0 ng/mL～400.0 ng/mL，相关系数（r2）不低于0.996，检出限（以S/N=3），在0.2 ng/mL～1.0 ng/mL之间。
2.4 方法的精密度和回收率
以100.0 ng/mL的PAHs标准溶液连续进样7次，其相对标准偏差范围为1.67 %～4.38 %。按照试验优化的条件分析样品萃取液，用外标法测定，50.0 ng/mL和100.0 ng/mL两个水平的回收率实验结果如表2所示。
表2 15种PAHs的回收率实验
Table 2 The recoveries of PAHs
注：1.未检出；2.
±SD。
实验2萃取液浓度2/ （ng/mL）实验1序号 化合物名称 加标浓度/ （ng/mL）加标后浓度2/ （ng/mL） 回收率/% 加标浓度/ （ng/mL）1加标后浓度2/ （ng/mL） 回收率/%苊烯 nd1 50.0 41.1±1.9 82.2 100.0 71.2±3.5 71.2 2 苊nd 50.0 42.9±2.3 85.8 100.0 76.7±4.1 76.7 3 3.3±0.2 50.0 30.8±1.3 55.1 100.0 62.0±3.6 58.6 4 菲16.9±1.6 50.0 69.5±2.8 105.2 100.0 104.6±5.9 86.5 芴5 1.8±0.2 50.0 56.6±2.8 109.7 100.0 83.0±5.1 81.1 6荧蒽 6.6±0.6 50.0 65.3±4.1 117.4 100.0 99.9±7.2 92.9 7 芘6.3±0.2 50.0 65.5±3.4 118.3 100.0 101.2±7.8 94.7 蒽8 苯并（a）蒽 1.6±0.1 50.0 64.9±4.4 126.6 100.0 93.4±11.3 91.8 9 屈3.0±0.2 50.0 51.8±4.2 97.5 100.0 75.5±6.5 72.3 10 苯并（b）荧蒽 nd 50.0 56.5±4.5 112.9 100.0 82.2±12.5 82.2 11 苯并（k）荧蒽 nd 50.0 49.3±4.5 98.5 100.0 71.2±9.3 71.2 12 苯并（a）芘 nd 50.0 52.4±3.5 104.8 100.0 71.1±10.9 71.1 13 茚并（1，2，3-cd）芘 nd 50.0 60.6±4.9 121.3 100.0 75.0±11.3 75.0 14 二苯并（a，h）蒽 nd 50.0 38.6±3.0 77.2 100.0 64.9±12.9 64.9 15 苯并（g，h，i）苝 nd 50.0 43.1±2.7 86.2 100.0 79.6±10.5 79.6
从表2可知15种PAHs回收率大多数在70.0 %～120.0 %之间，结果满意。
2.5 实际样品分析
取市售食用槟榔进行分析，在进样量相同的情况下其测定结果和加标试验结果如图7所示。
图7 样品测定结果及回收率实验
Fig.7 Analytical results and recovery test of samples
样品1的PAHs的含量在2.0 μg/kg～21.3 μg/kg；样品2的PAHs的含量在8.8 μg/kg～286.9 μg/kg。样品1的回收率在明显优于样品2，因此根据样品中被测目标的含量要选择适宜的进样量，以便获得较好的准确度。
本文采用凝胶渗透色谱去除被测样品中分子大小不在被测对象范围的杂质，然后再利用分散固相萃取去除与被测对象极性相差较大的化合物。试验结果表明，用凝胶渗透色谱和分散固相萃取联用净化技术处理食用槟榔样品，用GC-MS外标法测定样品的PAHs的含量的方法是可行的，试验结果满意。
参考文献：
[1]尹怡,郑光明,朱新平,等.分散固相萃取/气相色谱－质谱联用法快速测定鱼、虾中的16种多环芳烃[J].分析测试学报,2011,30(10): 1107-1112
[2]王丽,金芬,李敏洁,等.分散固相萃取－气相色谱－串联质谱法测定蔬菜中多环芳烃及卤代多环芳烃[J].分析化学, 2013, 41(6): 869-875
[3] A Dugay,C Herrenknecht,M Czok,et al.New procedure for selective extraction for polycyclic aromatic hydrocarbons in plants for gas chromatographic-mass spectrometric analysis[J]. Journal of Chromatography A,2002,958:1-7
[4]聂静,钱岩,段小丽,等.食品中多环芳烃的健康危害及防治措施[J].环境与可持续发展,2009(4):38-41
[5]海南省质量技术监督局. DB43 132-2004.食用槟榔[S].
[6]农业部农垦局. NY/T 487-2002.槟榔干果[S].北京:中国标准出版社,2002
[7]何秀芬,罗金辉,陈歆,等.气质联用法测定干槟榔中苯并(a)芘含量[J].热带农业科学,2012,32(1):61-64
[8]中华人民共和国卫生部. GB/T 5009.27－2003.食品中苯并(a)芘的测定[S].北京:中国标准出版社,2004
[9]国家粮食局.GB/T 22509－2008.动物油脂苯并(a)芘的测定反相高效液相色谱法[S].北京:中国标准出版社,2009
[10]中华人民共和国农业部渔业局. SC/T 3042－2008.水产品中16中多环芳烃的测定气相色谱－质谱法[S].北京:中国标准出版社,2004
[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫局. GB/T 23213－2008.植物油中多环芳烃的测定气相色谱－质谱法[S].北京:中国标准出版社,2009
[12]国家粮食局. GB/T 24893－2010.动植物油脂多环芳烃的测定[S].北京:中国标准出版社,2010
[13]曾浩.海洋鱼组织中多环芳烃的分析方法研究[D].北京:北京化工大学,2011
Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Edible Betelnet by GC－MS
Abstract：A gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）method was developed for the determination of fifteen polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）in edible betelnet. The analytes were extracted ultrasonically from edible betelnet samples by hexane，and purified by gel permeation chromatography（GPC）and dispersion solid phase extraction（DSPE），then analyzed by GC-MS with external standard method. Under the optimized conditions，the correlation coefficients（r2）of PAHs in linear range were not less than 0.996，the limits of detection were 0.2 ng/mL-1.0 ng/mL and the relative standard deviations（RSD）were lower than 4.38 %.the result of recoveries were satisfied. The results showed that the method is feasible for analysis on PAHs in edible betelnet.
Key words：edible betelnet；polycyclic aromatic hydrocarbons；gel permeation chromatography；dispersion solid phase extraction；GC-MS
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.032
基金项目：国家质检总局科技计划项目（2013QK243）
收稿日期：2015-01-20