高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中18种β-受体兴奋剂

徐成钢1，胡巧茹1，崔嘉1，颜鸿飞2，杨丽君1，*
（1.威海出入境检验检疫局，山东威海264205；2.湖南省检验检疫科学研究院，湖南长沙410004）

摘　要：建立一种同时测定牛肉中18种β-受体兴奋剂残留量的高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。样品加入乙酸铵缓冲液，β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解过夜，经固相萃取柱净化、浓缩、定容后，采用Thermo Hypersil Gold（2.1 mm×100 mm，3 μm）色谱柱，液相色谱串联质谱法在正离子模式下检测。该方法所有β-受体兴奋剂在0.5 μg/kg～10 μg/kg浓度范围内线性良好，定量限均为0.5 μg/kg。0.5、1.0、2.5 μg/kg 3个浓度添加水平平均回收率在68.5 %～91.9 %之间，变异系数在4.2 %～13.2 %之间。本方法灵敏度高，重现性好，操作简单、经济，可用于牛肉中β-受体兴奋剂动剂残留的检测确证。

β-受体兴奋剂是天然的儿茶酚胺类化学合成的衍生物，选择性作用于β-肾上腺受体。β-受体兴奋剂根据苯环取代基结构可分为苯胺型、苯酚型、间苯二酚型。20世纪80年代以来β-受体兴奋剂被用于畜牧生产以提高瘦肉率，但β-受体兴奋剂会在动物组织中长时间残留，长期食用将会引起中毒[1]。欧盟、日本、韩国等国家都规定禁止进口含有此类药物的肉制品。2002年我国农牧发[2002]1号文明确规定盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺为禁用药物，实施例行监测以来，动物养殖业中非法使用这几种违禁药物的行为得到了有效遏制，但为了获取高额利润，违法分子转而使用其它新型β－受体兴奋剂。因此建立一种简单快速、灵敏度高的多种β－受体兴奋剂同时检测的方法是十分必要的。

目前，动物源性食品中β-受体兴奋剂残留的检测方法主要有酶联免疫法[2-3]、高效液相色谱法[4-5]、气质联用法[6-9]和液质联用法[10-16]等。高效液相色谱串联质谱法因具有抗干扰能力好、灵敏度高、确证能力强等优点，已成为目前主要的检测和确证方法。

β-受体兴奋剂研究大多集中在盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺，多种β-受体兴奋剂的研究近几年刚刚开始，且多集中在猪产品上，本研究旨在建立牛肉中18种β-受体兴奋剂残留检测方法，适合于生产过程监控和日常监督检测和确证分析。

1　材料与方法

1.1　仪器与试剂

Agilent1200高效液相色谱仪：美国Agilent公司；API4000串联四极杆质谱仪（配有电喷雾离子源（ESI）：美国AB公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机：日立公司；BUCHI旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；MS3旋涡混合器：IKA公司。

β-葡糖苷醛甙酶-芳基硫酸酯酶：德国Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸胺均为色谱纯；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

莱克多巴胺（ractompamine ract）、克伦特罗（clenbuterol clen）、沙丁胺醇（salbutamol sal）、溴布特罗（bromburerol bro）、特布它林（terbutalin ter）、班布特罗（bambuterol bam）、喷布特罗（penbutolol pen）、非诺特罗（fenoterol fen）、齐帕特罗（zilpaterol zil）、苯乙醇胺A（phenylethanolamine A phe）、阿福特罗（arformorerol arf）：Dr. Ehrenstorfer；西马特罗（cimaterol cima）、苯氧丙酰胺（isoxsuprine iso）、妥布特罗（tulobuterol tul）、西布特罗（cimbuterol cimb）、马布特罗（mabuterol mab）、氯丙那林（clorprenaline clo）、普奈洛尔（Propranolol pro）：TRC公司。

1.2　标准溶液的制备

用甲醇溶解标准品，配成浓度为100 mg/L的单标储备液，于-18℃条件下储存备用。使用时根据需要配成适宜浓度的混合标准中间液和标准工作液。

准确称取5.00 g粉碎好的样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，依次加入20mL乙酸铵缓冲液（0.02mol/L，pH 5.2）、适量的硅藻土和50 μL酶，涡漩混匀，37℃振荡温育过夜。反应完毕后，10℃以下、8 000 r/min离心10 min，取上清液过HLB小柱（预先用甲醇、水各5 mL活化），流速控制在约1 mL/min，依次用3 mL水、3 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱，最后使用6mL甲醇洗脱。收集洗脱液，置于50℃水浴中用氮气流吹干，用0.1 %甲酸水溶液（v/v）定容成1.0 mL，旋涡混匀后过0.22 μm有机相滤膜，供HPLC-MS/MS测定分析。

1.4　液相色谱条件

色谱柱：hermoHypersilGold（2.1mm×100mm，3μm）；柱温35℃；进样体积20 μL；流动相：A：0.1 %甲酸水溶液，B：乙腈，流速：0.2 mL/min，梯度洗脱：t= 0 min，4 % B；t= 2 min，4 % B；t=5 min，23 % B；t=8 min，56 % B；t=12 min，95 % B；t=24 min，95 % B；t=24.1 min，4 % B；t=32 min，4 % B。

电喷雾电离源正离子扫描（ESI+），多反应监测模式（MRM）；电喷雾电压：5.5 kV；离子源温度：550℃，雾化气压力（GSl）：65 psi；辅助气流速（GS2）：60 psi，气帘气压力（CUR）：40 psi；碰撞室入口电压（EP）：10 V；碰撞室出口电压（CXP）：13 V。监测离子对、去簇电压（DP）、碰撞能量（CE）如表1所示。

2　结果与讨论

2.1　样品前处理条件的选择

β-受体兴奋剂类药物根据苯环上取代基的不同分为苯胺型、苯酚型和间苯二酚型3类，在机体内经过吸收、转化、代谢后，终产物主要以原型药和轭合物形式（主要包括硫酸轭合物和葡萄糖醛酸轭合物）存在，使用酶对组织成份进行水解，可使药物释放出来，处理时加入适量硅藻土可使酶解的样液在离心后分层明显，澄清，利于通过固相小柱，不发生堵塞。β-受体兴奋剂类药物主要通过液液分离和固相萃取柱净化。液液分离主要根据其在酸性条件下以离子态存在，易溶于水，碱性条件下易溶于有机溶剂的特点进行净化，由于试验中18种受体兴奋剂化学性质的差异，液液分离方式对有的种类效果并不理想；固相萃取柱主要有SCX和MCX，本文采用HLB小柱，可达到理想的净化效果。

2.2　液相色谱条件的选择

在研究中采用了Agilent Zorbax SB-C18、XDBC18、Thermo Hypersil Gold 3种色谱柱，通过调整流动相比例和梯度均能达到满意的峰形和分离效果，相比较Thermo Hypersil Gold（2.1 mm×100 mm，3 μm）色谱柱出峰较早，杂峰干扰较少。选取甲醇流动相时，响应值会增加，但做样品时，基线噪音也会增加，因此选用乙腈做流动相。

2.3　质谱分析条件的优化

选择ESI（+）模式。采用针泵进样方式分别对分析物进行质谱条件优化，每种分析物选取丰度较高的3个～4个碎片离子作为子离子，配制不同种类空白样品基质标准溶液，剔除易受基质干扰的子离子。在MRM模式下优化各种质谱条件最终选定的特征离子及优化的质谱分析参数见表1。由于在实际检测中，样品往往会出现干扰，靠调整液相洗脱梯度条件来避开，会浪费大量时间，因此表中有的化合物选取了3个子离子，当其中一个离子受到干扰时，可选取其它两对离子，符合欧盟2002/657/EC决议对兽药残留物质谱确证分析的方法学要求（Identification points≥4）。β-受体兴奋剂特征离子色谱图见图1。

2.4　方法的线性范围、检出限及精密度

按1.3制备不含待测组分的空白基质溶液，，配制成一系列基质标准工作溶液，上机测定，以峰面积（Y轴）对相应的β-受体兴奋剂的浓度（X轴）绘制标准曲线。结果表明，β-受体兴奋剂在0.5 μg/kg～10.0 μg/kg（相当于样品）浓度范围内，18种β-受体兴奋剂的基质匹配标准校正曲线的线性良好，相关系数r均大于0.99（见表2）。

经实际样品检测，考虑到回收率和基质的影响，确定本方法在检测牛肉时的定量限为0.5 μg/kg。

选用不含分析物的空白样品，分别添加浓度为0.5、1.0、2.5 μg/kg 3个浓度水平的混合标准溶液，每个水平6平行，按建立的方法进行测定，基质匹配校正曲线定量分析并计算其回收率和精密度，测得平均回收率在68.5 %～91.9 %之间，变异系数在4.2 %～13.2 %之间（表2）。说明该方法具有较好的回收率、稳定性和重复性，完全可以满足牛肉中18种β-受体兴奋剂的日常检测要求。

3　　结论

本研究通过酶解过夜、固相萃取等方式对样品进行提取净化，建立了牛肉中18种β-受体兴奋剂的高效液相色谱-质谱检测方法，通过日常检测应用表明：该方法不仅灵敏度高、重现性好，而且前处理简单、经济、快速，非常适牛肉中β-受体兴奋剂的快速检测，能满足β-受体兴奋剂类药物的残留检测任务。

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Determination of 18 β-Agonists Residues in Beef by High Performance Liquid Chromatographytandem Mass Spectrometry

XU Cheng-gang1，HU Qiao-ru1，CUI Jia1，YAN Hong-fei2，YANG Li-jun1，*
（1. Weihai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weihai 264205，Shangdong，China；2. Hunan Province Academy of Inspection and Quarantine，Changsha 410004，Hunan，China）

Abstract：A method based on high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（HPLC-MS/ MS）has been developed for the determination of 18 β-agonists residues in beef.The analytes were extracted with ammonium acetate solution and hydrolysised with beta-glucuronidase overnight.After being cleaned up with column，concentrated and reconstituted，the analytes were separated by HPLC with an Thermo Hypersil Gold column（2.1 mm×100 mm，3 μm）under the mobile phase containing 0.1 % formic acid and acetonitrile. Identification and quantification were achieved by HPLC-MS/MS with multiple reaction monitoring（MRM）via positive-ion mode.The method showed good linearity in the range from 0.5 μg/kg to 10 μg/kg，The limit of quantitation of all β-agonists were 0.5 μg/kg. The overall recovery varied from 68.5 % to 91.9 % at the spiked level of 0.5，1.0，2.5 μg/kg and the relative standard deviation of the method varied from 4.2 % to 13.2 %.The method is sensitive，reproducible，simple and economic，the method adapts to the determination of β-agonists residues in beef.

Key words：β-Agonists；beef；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

基金项目：国家科技支撑计划（2012BAK08B01）；质检公益性行业科研专项（201310143）；国家质检总局科技计划项目（2013IK178）

作者简介：徐成钢（1971—），男（汉），高级工程师，硕士，主要从事食品检测工作。

*通信作者：杨丽君，高级工程师，硕士，研究方向：食品检测。

高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中18种β-受体兴奋剂

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

1　材料与方法

2　结果与讨论

3　　结论