摘 要：以豆渣为原料，研究了β-甘露聚糖酶酶解法与纤维素酶酶解法提高豆渣可溶性膳食纤维（SDF）含量的工艺。结果表明，纤维素酶酶解法进一步提高挤压后豆渣SDF含量的最优工艺为：酶解温度50℃，酶解时间3 h，酶与底物质量比1∶500，此条件下豆渣SDF含量为（30.10±0.17）%。β-甘露聚糖酶酶解法制得高含低聚糖SDF的最佳工艺参数：酶解温度60℃，酶解时间4 h，酶与底物质量比1：50。将酶解产物经中空纤维超滤膜进行超滤，将滤出液浓缩干燥后得到的低聚糖粗品得率为37.67 %。高效液相色谱（HPLC）分析结果表明该低聚糖粗品中有4种不同聚合度的低聚糖存在，总含量40.31 %，其中含量最高的组分为分子量1 349 Da，其含量为27.65 %，根据其分子量进行推测，这可能是一种聚合度为8的低聚糖。通过葡聚糖凝胶Sephadex G25分离低聚糖粗品，分离得到一种主要组分，通过Sephadex G15验证纯度，证明分离得到的组分是单一组分的低聚糖。经计算，得到的豆渣低聚糖含量为3.7 g/100 g（以干豆渣计）。温下整个试验贮藏期间果汁透光率都大于90 %，试验还表明壳聚糖对柚子汁的澄清不影响果汁的营养价值。
关键词：豆渣；β-甘露聚糖酶；可溶性膳食纤维；低聚糖
豆渣是豆腐、豆浆、豆皮等豆制品生产加工过程中产生的主要副产物，其质量约占全豆干重的15 %～20 %。我国大豆食品加工产业十分发达，每年产出的湿豆渣总量约为2 000万t[1]。虽然我国豆制品加工业发达，但目前对豆渣的利用率却处在较低水平，除了少部分豆渣被用作饲料之外，大多都被废弃，造成了极大的资源浪费，同时废弃的豆渣处理不当，会对环境造成污染。
膳食纤维是一类对人体有着特殊重要生理功能的化合物，被营养学家定义为人类的第七大营养素[2]。
根据膳食纤维定义委员会定义，膳食纤维（Dietary Fiber，DF）为非淀粉多糖和不被人体消化的低聚糖类。按其不同的溶解特性，又可分为可溶性膳食纤维（Soluble Dietary Fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（Insoluble Dietary Fiber，IDF）[3]。
豆渣中富含膳食纤维和优质蛋白，还含有多种矿物质和微量元素，因此豆渣是一种极具开发价值的、价廉质优的膳食纤维资源。豆渣中约有60 %的膳食纤维，但是SDF的含量是很低的。为了提高豆渣中SDF的含量，使用不同的方法，例如化学或者酶处理等[4-5]。
β-甘露聚糖酶是一类能水解含有β-1，4-D-糖苷键的甘露低聚糖和多糖的内切酶，属于半纤维素酶类。由于禽畜和鱼类体内不含β-甘露聚糖酶，所以需要添加外源酶帮助个体进行β-甘露聚糖的转化。有研究表明，在饲料中添加一定量的β-甘露聚糖酶可以有效降低消化道内容物黏度、从而改善肠道微生物菌群平衡、保护肠粘膜的完整性、最终达到提高畜禽免疫机能和饲料转化率的目的[6-8]。
本研究以新鲜豆渣为原料，利用挤压喷雾技术[9-10]处理豆渣，在“挤压喷雾”的基础上，通过纤维素酶的酶解作用进一步提高挤压后豆渣的SDF的含量，以酶解温度、酶解时间和酶添加量（酶与底物质量比）为参数，通过单因素和正交试验确定各因素对SDF含量的影响，并确定最佳工艺。为进一步利用β-甘露聚糖酶酶解豆渣生产高含低聚糖豆渣膳食纤维，研究了β-甘露聚糖生产、分离、纯化的工艺。
1.1 材料
豆渣（含水量80 %～85 %）：天津山海关豆制品有限公司；β-甘露聚糖酶：Sigma公司。
1.2 挤压喷雾生产豆渣膳食纤维
按照本研究前期开发的研究方法[9]，利用自制的喷雾挤压机将水分含量约为80 %～85 %的新鲜豆渣挤压生产出豆渣纤维样品（含水量为55 %～65 %）。条件：温度160℃，转速100 r/min，模头直径为4 mm，喂料速度1.5 kg/min。收集被挤压出的豆渣，60℃下进行干燥处理，干燥后进行粉碎过60目筛网后得到豆渣粉。使用同样的方法获得新鲜豆腐渣粉末作为对照。
1.3 豆渣SDF的提取
将10 g豆渣样品中放入400 mL水中，在121℃下回流60 min。将混合物以3 000 r/min的离心力离心20 min。将所有的上清液合并，α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶水解30 min。溶液pH为4.5，在溶液加入蛋白酶水解1 h。经过高温灭酶后，将溶液以5 000 r/min的离心力离心30 min。在真空下条件下上清液浓缩成原始体积的10 %，增加4倍体积的95 %乙醇，4℃下沉淀24 h。将沉淀物离心（3 000 r/min离心力，15 min）并真空冷冻干燥，获得SDF样品。
1.4 低聚糖的制备
取5 g经喷雾挤压豆渣样品溶解在250 mL蒸馏水，使用纤维素酶酶解挤压后豆渣，酶解条件为：酶解温度50℃；酶解时间3 h；酶与底物质量比1∶500。进一步，取3 g经纤维素酶处理后的豆渣（干基）溶解在150 mL蒸馏水中，使用β-甘露聚糖酶进一步酶处理来提高低聚糖的含量，酶解条件为：酶解温度60℃；水解时间4 h；酶和底物的质量比1∶50。使用中空纤维超过滤法在水解产物中分离粗寡糖[11]。达到分子量为10 kDa、超滤压力低于0.1 MPa、超过滤2次后停止。收集过滤后的液体，然后浓缩，并冷冻干燥，得到粗的低聚糖固体。
1.5 豆渣SDF相对分子质量的测定
豆渣SDF相对分子质量的测定采用高效液相色谱法。
色谱条件：GPC色谱柱：OHpak SB-802.5 HQ；流动相为三蒸水；流速设为0.8 mL/min；柱温30℃；柱压3.0 MPa；检测器为示差折光检测器。配制浓度为10 mg/mL的样品，进样量为20 μL。
1.6 豆渣SDF单糖组成测定
气相色谱法测定样品的单糖组成。色谱条件为：毛细管色谱柱OV-1701（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；检测器为氢火焰离子化检测器（FID）；以N2为载气；升温程序设定为：初温150℃，保留1 min，以10℃/min升温至200℃，保留10 min，随后以5℃/min升温至220℃，保留5 min，最后以1.5℃/min升温至终温240℃，并保留20 min。进样口温度设定为240℃；检测器温度为280℃；进样量3 μL；分流比为10∶1。根据样品气相色谱图谱中各峰的出峰时间推测单糖组成，通过各峰的面积比例可以推算出单糖组成的摩尔比。
2.1 喷雾挤压参数对豆渣SDF含量的影响
经喷雾挤压处理后，豆渣SDF含量从6.2 %提高到24.1 %[12]。这是由于高温高压诱导，导致多糖糖苷键的加速解聚，从而提高了可溶性膳食纤维的含量。根据最佳酶解条件的单因素试验结果，设计三因素三水平的正交试验[（其中酶解温度选择40、50、60℃，酶解时间选择1、2、3 h，加酶量（质量比）分别设定为1∶1 000、1∶500、1∶250）]。以确定纤维素酶酶解法提高豆渣SDF含量的最佳参数。正交试验结果与分析如表1、表2所示。
表1 纤维素酶酶解条件正交试验结果表
Table 1 The results of Cellulase hydrolysis parameters orthogonal test
试验号 A酶解温度/℃ B酶解时间/h C加酶量 SDF含量/% 1 40 1 1∶1 000 24.3 2 40 2 1∶500 30.1 3 40 3 1∶250 28.6 4 50 1 1∶500 26.9 5 50 2 1∶250 30.0 6 50 3 1∶1 000 28.1 7 60 1 1∶250 25.7 8 60 2 1∶1 000 26.7 9 60 3 1∶500 27.5 k1 27.7 25.6 26.4 k2 28.4 28.9 28.2 最优组合k3 26.6 28.1 28.1 A2B2C2R 1.7 3.3 1.8
由正交试验的直观分析结果可以看出，3个因素对SDF含量的影响强弱顺序为酶解时间＞加酶量＞酶解温度，每个因素的各自3个水平对SDF含量的影响强弱次序为A2＞A1＞A3，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，因此正交试验确定的最优参数组合为A2B2C2。
正交试验的方差分析如表2所示。
表2 L9（33）挤压正交试验方差分析结果
Table 2 L9（33）Variance analysis results of extrusion orthogonal test
注：*表示有显著性，α=0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性酶解温度 4.436 2 5.687 19.000酶解时间 17.773 2 22.786 19.000 *加酶量 6.216 2 7.969 19.000误差 0.78 2
通过方差分析看出，酶解时间对豆渣SDF含量有显著性影响，其他条件影响不显著。
根据正交试验结果，在pH 4.5的环境下，酶解温度50℃、酶解时间3 h、加酶量1∶500条件下进行验证试验，得到豆渣SDF含量为（30.10±0.17）%（n=3）。2.2豆渣中SDF分子量的测定
SDF的分子量由挤出的豆渣决定，结果如表3所示。
表3 豆渣SDF分子质量分布
Table 3 The molecular weight distribution of okara SDF
出峰时间/min数均分子质量（Mn）重均分子质量（Mw）Z均分子质量（Mz）Mw/Mn Mz/Mw 峰面积比例/% 6.645 117 096 2.836× 1 011 8.609× 1 012 2 422 212.168 55 30.354 41 91.866 4 8.241 3 302 3 837 4 469 1.161 97 1.164 76 6.805 7 10.269 687 690 694 1.005 20 1.005 14 0.629 4 11.640 75 105 127 1.396 56 1.212 86 0.620 9
由表3可知，经挤压喷雾并纤维素酶酶解处理后的豆渣SDF中主要组分数均分子量为117 096，其含量约为91.87 %，低聚糖成分仅为0.63 %。
SDF水解和超滤后获得粗低聚糖，产量为37.67 g/ 100 g（以干豆渣计）。
粗低聚糖分子量如表4所示。
表4 粗低聚糖分子质量分布
Table 4 The molecular weight distribution of crude oligosaccharides
出峰时间/min （Mz） Mw/Mn Mz/Mw 峰面积比例/% 7.121 42 670 2 999 746 1 313 195 819 70.301 02 437.769 01 42.071 8 7.563 8 357 8 647 8 943 1.034 65 1.034 25 6.670 7 7.790 4 711 4 828 4 941 1.025 00 1.023 26 6.315 0 9.343 1 349 1 507 1 731 1.117 75 1.148 51 27.645 5 9.867 847 848 849 1.000 68 1.000 68 1.094 6 10.275 682 688 694 1.008 43 1.008 25 5.022 1 11.039 349 374 398 1.070 28 1.064 74 6.545 8 11.422 159 163 168 1.029 63 1.028 22 2.052 1 11.656 68 78 85 1.140 00 1.094 58 1.690 0数均分子质量（Mn）重均分子质量（Mw）Z均分子质量
与SDF相比，粗低聚糖分子量有很大改变。由表4数据可知，该混合物中共有4种组分分子量在此范围内，即有4种不同聚合度的低聚糖存在，分子量分别为1 349、847、682、349 Da，总含量占总低聚糖粗产物的40.31 %，其中含量最高的组分为分子量1349Da的组分，其含量约占总低聚糖粗产物的27.65%，根据其分子量推测，这可能是一种聚合度为8的低聚糖（八糖的分子量理论值为1 314 Da）。此外分子量8 357 Da 和4 711 Da的小分子多糖也占了总低聚糖粗产物的12.99 %左右，这说明β-甘露聚糖酶的酶解反应确实降解了豆渣SDF中部分大分子糖类物质，使其转化为低聚糖和小分子多糖。这一结果说明以豆渣为原料经“挤压喷雾”和酶解法相结合制得高含低聚糖的豆渣膳食纤维是可行的。在挤压喷雾和酶水解后，低聚糖成份在豆渣中为3.7 %，远远超过普通豆渣中的低聚糖含量。
2.3 低聚糖主要成分的分离
2.3.1 SephadexG-25葡聚糖凝胶对低聚糖粗品的分离由表1可知，低聚糖粗产物中主要的低聚糖组分分子量为1 349 Da，故采用葡聚糖凝胶柱层析法对该组分进行分离。选择分子量为3 000的葡聚糖标准品Dextran T3作为对照。标品与粗低聚糖样品在Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱层析柱中的洗脱曲线分别如图1、图2所示。
图1 Dextran T3洗脱曲线
Fig.1 Elution curve of Dextran T3
图2 低聚糖粗品洗脱曲线
Fig.2 Elution curve of crude oligosaccharides
在葡聚糖凝胶柱层析法中，分子量越大的组分与葡聚糖凝胶颗粒的结合能力越差，故而越先被流动相洗脱出来，即洗脱时间早，管数靠前。
在本研究中，由于目标组分的分子量为1 349 Da，小于标品的分子量，故洗脱峰应在标品管号之后，由于目标组分占总物质含量的27.65 %左右，所以第52管之后的第一个大洗脱峰即为要收集的目标组分，所以收集第59～63管洗脱液作为目标组分进行纯度鉴定。
2.3.2 Sephadex G-15葡聚糖凝胶对目标产物的纯度鉴定
通过Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱对收集的目标产物进行纯度鉴定，其洗脱曲线如图3所示。
图3 低聚糖产物洗脱曲线
Fig.3 Elution curve of oligosaccharides product
如图3所示，收集的该产物在Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析的洗脱曲线为呈现出单一的对称峰，这说明该物质为单一组分。因此证明Sephadex G-25葡聚糖凝胶对目标低聚糖组分的分离效果良好。所得到的产物为单一组分的低聚糖。
2.4 豆渣SDF单糖组成的测定
单糖标准品的气相色谱检测结果见图4。豆渣SDF气相色谱图见图5。
图4 标准单糖气相色谱图
Fig.4 GC chromatogram of complex monosaccharide derivative
图5 豆渣SDF气相色谱图
Fig.5 GC chromatogram of okara SDF
由图5可知，OV-1701毛细管柱可以很好分离出9种单糖。单糖出峰的顺序为：岩藻糖（20.044 min）、核糖（20.335 min）、鼠李糖（20.943 min）、阿拉伯糖（21.446 min）、木糖（22.842 min）、山梨糖（32.090 min）、甘露糖（33.048 min）、半乳糖（33.591 min）、葡萄糖（34.749 min）。
从结果中可以看出，这8种单糖在豆渣SDF中都有不同程度的存在，但其摩尔比略有差异。挤压喷雾处理后豆渣SDF中甘露糖、半乳糖、山梨糖所占比例较高。
表5 豆渣SDF气相色谱检测结果
Table 5 Retention time and peak area of okara SDF
单糖组成 出峰时间/min 峰面积比/% 摩尔比岩藻糖 20.044 2.61 0.098核糖 20.335 0.89 0.041鼠李糖 20.943 0.70 0.026阿拉伯糖 21.446 1.12 0.05木糖 22.842 1.80 0.082山梨糖 32.090 26.36 1甘露糖 33.048 25.50 0.96半乳糖 33.591 41.16 1.56
喷雾挤压显著增加豆渣中SDF的含量，豆渣膳食纤维通过β甘露聚糖酶酶解作用可获得更高含量的低聚糖。低聚糖含量从0.63 %增长到3.7 %，增加近5倍。低聚糖成分的分子量为1 369 Da，含量约为27.65 %。主要是由鼠李糖、山梨糖醇、甘露糖和半乳糖组成。半乳糖和甘露糖的浓度非常高，分别为39.81 % 和31.78 %。
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Study on Preparation Processing of Okara Dietary Fiber with Oligosaccharides Content
Abstract：Okara was used as materials to determine the optimum parameters to improve the soluble dietary fiber（SDF）content in okara of β-mannanase enzymatic method and its composition were determined.The results showed that the optimum parameters of further improved the SDF content of extruded okara with cellulase enzymatic method were：enzymatic temperature 50℃，enzymatic time 3 h，enzyme amount（the mass ratio of enzyme and the substrates）1∶500. In this condition，the SDF content of enzymolysis okara was（30.10±0.17）%. The optimum parameters of preparation of high oligosaccharides content SDF according to β-mannanase enzymatic method were：enzymatic temperature 60℃，enzymatic time 4 h，enzyme amount（the mass ratio of enzyme and the substrates）1∶50. After enzymatic hydrolysis，the mixture was subjected to ultrafiltration by Hollow fiber ultrafiltration membrane. The filtrate was concentrated and lyophilized，the yield of crude oligosaccharide was 37.67 %. High performance liquid chromatography（HPLC）analyze showed that the crude oligosaccharide had four kinds of oligosaccharide with different degree of polymerization，total amount was 40.31 %. The content of the best group is divided into molecular weight 1 349 Da，its content is 27.65 %. The degree of the oligosaccharide may be eight when speculated based on the molecular weight. A major oligosaccharide component was obtained when separated the oligosaccharide fractions with dextran gel Sephadex G25. The purity of the main component was verified by Sephadex G15，the results showed that the separated component was a single component oligosaccharide. After calculation，the okara oligosaccharides content obtained through this research was 3.7 g/100 g（in dry okara）.
Key words：okara；β-mannanase enzymatic；soluble dietary fiber；oligosaccharides
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.029
收稿日期：2014-10-30