摘 要：以系水力、蒸煮损失率、剪切力和感官评定为评价指标，通过注射菠萝蛋白酶液，结合滚揉处理，研究菠萝蛋白酶在不同的添加量、处理温度、处理时间和pH条件下对马肉（半腱肌）嫩度的影响，采用L9（34）正交试验对嫩化条件进行优化。试验结果表明：蛋白酶添加量、处理温度和处理时间对马肉的嫩度有显著影响。菠萝蛋白酶的最佳嫩化条件是：菠萝蛋白酶添加量12 U/g，处理温度60℃，处理时间1.5 h，pH7.0；或者菠萝蛋白酶添加量16 U/g，处理温度60℃，处理时间2 h，pH7.0。
关键词：马肉；菠萝蛋白酶；滚揉；嫩度
*通信作者
随着人们生活水平的提高，人们对肉的需求量越来越大，对肉的品质要求也越来越高。马肉具有高蛋白、低脂肪、低胆固醇的特点，不但具有很好的风味，还具有很高的营养价值[1]。肉的食用品质与肉品的内在质量密切相关，主要反映在肉的色泽、风味、质构等方面，人们通常用肉的颜色、风味、嫩度、保水性能、多汁性等品质指标来评价肉与肉制品的食用品质[2]。在肉的食用品质特性中，色泽、持水能力及气味在蒸煮前后都可测定，给消费者的感官印象较为持久，而多汁性、质地、嫩度、滋味和香味只能在咀嚼的过程中获得，持续时间较短，所以消费者的感官评价是至关重要的[3]。嫩度是消费者评价肉质优劣最常用指标，也是最重要的指标[2]。菠萝蛋白酶是存在于菠萝植株中的蛋白酶系，属于巯基蛋白酶类[4]，是各种酶的混合物。菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂能分解蛋白酶、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫰化、水解蛋白、啤酒澄清等，可用于肉类加工过程中的嫰化过程，可以显著提高肉的适口性[5]。
本试验以新鲜马肉（腿部半腱肌）为原料，通过测定系水力、蒸煮损失、剪切力和感官评定4个指标，结合滚揉处理，研究了菠萝蛋白酶在不同的蛋白酶添加量、处理温度、处理时间和pH对马肉嫩度的影响，通过单因素试验和正交试验对菠萝蛋白酶的嫩化条件进行了优化，为提高马肉的食用品质提供可靠的试验数据。
1.1 材料
马肉（后腿部半腱肌肉）：新疆昭苏县绿源食品有限责任公司；菠萝蛋白酶（50万U/g）：南宁庞博生物技术有限公司。
1.2 仪器和设备
便携式pH计：德图仪表（深圳）有限公司；数字显示温度计：美国Delta TRAK公司；电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；TA-XT2i型物性仪：英国Stable Micro System公司；电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；Tu-1810型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；GR-20真空滚揉机：诸城市美邦机械有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菠萝蛋白酶活力的确定[6]
采用紫外分光光度法测定，蛋白酶溶液1.0 mL与酪蛋白溶液5.0 mL混合，置（37±0.2）℃水浴中反应10 min，加三氯乙酸溶液终止反应，用干燥滤纸过滤，滤液在2 h内采用分光光度法以水为空白，在275 nm波长处测定吸光度A；酪蛋白溶液和三氯乙酸溶液顺序互换，其他操作相同，测定吸光度A0；另取酪氨酸对照溶液，以0.1 mol/L盐酸溶液为空白，在275 nm处测定吸光度An。在上述条件下，每分钟水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需粗蛋白酶的量为1个酶活力单位。
式中：W3为对照品溶液每1 mL中含酪蛋白的量，μg；W为供试样品的取样量，mg；11为测定总体积，mL；N为供试样品的稀释倍数；10为反应时间。
1.3.2 马肉嫩化处理的方法
用不同pH的磷酸盐缓冲液配置菠萝蛋白酶溶液，置于100 mL烧杯中，放置于恒温水浴锅中保温，将浸泡在蛋白酶液中的马肉进行注射蛋白酶液处理（注射量按肉重的1/10注射），然后将其用自封袋密封，置于滚揉机滚揉30 min，最后将其置于恒温水浴锅中保温，最后取出待测，马肉块的大小3 cm×3 cm×4 cm。
1.3.3 菠萝蛋白酶最佳嫩化条件的确定
根据单因素试验的结果，采用L9（34）正交试验对以上4个因素进行优化，以马肉的剪切力和感官评价作为最终评价指标，确定菠萝蛋白酶的最佳嫩化条件。
表1 菠萝蛋白酶嫩化马肉条件正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test on tenderization conditions of horsemeat with bromelain
水平 因素A酶添加量/（U/g） B温度/℃ C处理时间/h D pH 1 8 55 1 6.5 2 12 60 1.5 7.0 3 16 65 2 7.5
1.4 测定方法
1.4.1 剪切力和其他物性参数的测定
取100 g肉块置于蒸煮袋中，尽量将蒸煮袋中的空气排出，将袋口密封，在80℃恒温水浴锅中加热，当马肉中心温度达到70℃时，维持约30 min，然后冷却至室温取样。沿着肌纤维方向切取1 cm厚，1 cm宽的肉条，然后在TA-XT2i型物性仪上测定其剪切力，重复测量3次并取其平均值。
剪切力测定参数：探头HDP/BSW；测试模式TPA；测试前速度2.00 mm/s；测试速度2.00 mm/s；测试后速度10.00mm/s；下压距离30.00mm；负载类型Auto-20g；数据获得率500PPS；样品规格5 cm×1 cm×1 cm。
其他物性测定参数：探头P/5；测试模式TPA；测试前速度2.00 mm/s；测试速度1.00 mm/s；测试后速度1 mm/s；下压距离30.00 mm；负载类型Auto-20 g；数据获得率200 pps；样品规格5 cm×1 cm×1 cm。
1.4.2 蒸煮损失的测定
称取50 g左右的马肉切分成小块，放于蒸煮袋中，置于90℃水浴锅中加热。当牛肉的中心温度达到75℃时，取出样品，冷却至常温，用滤纸擦干表面水分，然后称重。蒸煮损失率按下式计算：
1.4.3 系水力的测定
采用离心法。精确称取5 g左右于离心管中，1 500 r/min离心30 min，取出肉样用定性分析滤纸吸去表面渗出的多余水分，称其质量，计算系水力。每个样品做3次平行，取其平均值。
1.4.5 感官分析
将经过处理的马肉置于蒸煮锅中蒸制2 h，自然冷却至室温后切块品尝，品尝者在评定前进行专业细致的培训，品尝实验会在独立的安静隔间内进行，评价标准如下表所示。
表2 感官评价表
Table 2 Sensory evaluation table
项目 评定指标和分值1分 2分 3分 4分 5分嫩度 非常硬/软 很硬/软 中等硬/软 有点硬/软软硬适中咀嚼性非常硬/软 很硬/软 中等硬/软 有点硬/软软硬适中风味 没有 轻微 中等 强烈 极强颜色色泽差，颜色不均匀色泽不佳，颜色不均匀色泽较好，颜色较均匀色泽好，颜色较均匀色泽好，颜色均匀
1.5 数据分析
物性数据采用Stable Micro System所带的Exponent处理分析，其他数据采用SPSS软件进行处理分析。
2.1 蛋白酶添加量对马肉嫩度的影响
菠萝蛋白酶添加量对马肉系水力、蒸煮损失和剪切力的影响如图1和图2所示。
图1 菠萝蛋白酶添加量对马肉系水力、蒸煮损失的影响
Fig.1 Effects of different bromelain doses on water-holding capacity，cooking loss of horse meat
图2 菠萝蛋白酶添加量对马肉剪切力的影响
Fig.2 Effects of different bromelain doses on shear force of horse meat
由图1和图2可以看出，随着菠萝蛋白酶添加量的不断增加，马肉的系水力和蒸煮损失率都呈现显著性变化，当蛋白酶的添加量在12 U/g时，系水力明显提升，蒸煮损失率显著下降，但是随着蛋白酶添加量继续增大，系水力明显下降，蒸煮损失变大，原因是蛋白酶作用过度，导致肌纤维断裂，保水力减低，失水严重。剪切力的变化呈现逐渐减小的趋势，当蛋白酶的用量为24 U/g时，此时的剪切力虽然最小，但是马肉的外观形态会受到严重破坏，失水较为严重，嫩化效果不好；当蛋白酶添加量在8 U/g～16 U/g时，嫩化效果较好，马肉的系水力和蒸煮损失都呈现较好的水平，此时的剪切力也呈现中等嫩度的水平，嫩化效果较佳。2.2处理温度对马肉嫩度的影响
处理温度对马肉系水力、蒸煮损失和剪切力的影响如图3和图4所示。
图3 处理温度对马肉系水力、蒸煮损失的影响
Fig.3 Effects of treating temperature on the water-holding capacity，cooking loss of horse meat
图4 处理温度对马肉剪切力的影响
Fig.4 Effects of treating temperature on shear force of horse meat
由图3和图4可知，处理温度对系水力和蒸煮损失率的影响较为明显，当处理温度为60℃，此时的系水力最大，为91.6 %，蒸煮损失率最小，为37.4 %，继续升高温度，系水力则会减小，蒸煮损失率也会升高，原因是温度过高，使菠萝蛋白酶部分失活，使其分解蛋白质的能力下降，进而导致保水性能下降；当处理温度较低时，此时蛋白酶的活性也会受到影响，嫩化效果不好。当处理温度为65℃时，此时的剪切力值最小，为4.563 kg；当处理温度为70℃时，此时剪切力值反而会有所升高。因此，当处理温度在60℃左右时，系水力和蒸煮损失率均处于较好的水平，剪切力值适中，嫩化效果最好。所以，菠萝蛋白酶的最佳温度在60℃左右，这和赵武玲等[7]和程安玮等[8]报道的菠萝蛋白酶的最适温度55℃～65℃也是一致的。
2.3 处理时间对马肉嫩度的影响
处理时间对马肉系水力、蒸煮损失和剪切力的影响如图5和图6所示。
图5 处理时间对马肉系水力、蒸煮损失率的影响
Fig.5 Effects of different treatment time on water-holding capacity，cooking loss of horse meat
图6 处理时间对马肉剪切力的影响
Fig.6 Effects of different treatment time on shear force of horse meat
由图5可知，随着处理时间的增加，马肉的系水力呈现先增加后减小的趋势，而蒸煮损失呈现相反的趋势，当处理时间为1.5 h时，此时的系水力最大，蒸煮损失率最小，分别为91.5 %和37.2 %，当处理时间过短时，系水力和蒸煮损失都不理想，原因是菠萝蛋白酶未能充分发挥其水解作用，嫩化效果不佳，保水性较差。反之，当处理时间过长，由于菠萝蛋白酶的水解作用时间太长，会造成水解过度，进而影响马肉的保水性能。由图6可以看出，剪切力值随着处理时间的增加剪切力明显下降，当处理时间为1 h时，剪切力值为4.843 kg，而当处理时间为1.5 h，剪切力值为4.454 kg，当作用时间继续增加时，由于菠萝蛋白酶水解过度，马肉的保水性能急剧下降，但马肉的外观形态会受到很大的影响，虽然此时的剪切力值很低，但是嫩化效果较差，因此处理时间在1 h和1.5 h时，嫩化效果较好。
2.4 pH对马肉嫩度的影响
pH对马肉系水力、蒸煮损失和剪切力的影响如图7和图8所示。
图7 不同pH对马肉系水力、蒸煮损失的影响
Fig.7 Effects of different pH on water-holding capacity，cooking loss of horse meat
图8 不同pH对马肉剪切力的影响
Fig.8 Effects of different pH on shear force of horse meat
由图7和图8可知，菠萝蛋白酶液所处的pH对马肉的系水力和蒸煮损失率的影响较为显著，菠萝蛋白酶液的pH在7.0左右时，马肉的系水力最大，蒸煮损失率较小，剪切力值最小，原因是菠萝蛋白酶此时处于较佳的活性状态，有利于将马肉中的胶原蛋白分解，进而提高肉的嫩度；这和张宏博等[9]报道的菠萝蛋白酶的最适pH在7.0也是一致的；pH5.0～pH6.0时，系水力和蒸煮损失率变化不大；当pH为7.5时，此时的剪切力有小幅度的升高，原因是此时的pH已经不在菠萝蛋白酶的最佳pH范围之内，菠萝蛋白酶的活性不能完全发挥。
2.5 菠萝蛋白酶嫩化条件的优化
根据单因素试验的结果，选择各个因素较佳的水平，以剪切力和感官评价为最终的评价指标，利用正交试验对嫩化条件进行优化，试验结果见表3。
通过正交试验结果可以看出，如果以剪切力作为评价指标，对马肉嫩度影响因素的先后顺序为蛋白酶添加量＞处理温度＞处理时间＞pH；如果以感官评定值为评价指标，对马肉嫩度影响因素的先后顺序为：蛋白酶添加量＞pH＞处理时间＞处理温度；从表4中也可以看出，当剪切力值最小时，感官评价分值并不是最高的，原因可能是剪切力太小，失去了肉的嚼劲，这对嫩度也会产生不好的影响，通常当肉的剪切力值在3 kg～4 kg之间时，肉的嫩度较好，因此A因素选择了A2为优。以剪切力为评价指标的最优组合为A2B3C3D2，以感官评价为评价指标的最优组合为A1B2C3D3。由于感官评价带有一定的主观性，所以最终以剪切力作为最终的评价指标，以感官评价作为参考；根据正交试验的试验数据，综合平衡优组合得出最优的嫩化条件为：菠萝蛋白酶添加量12 U/g，处理温度60℃，处理时间1.5 h，pH7.0；或者菠萝蛋白酶添加量16 U/g，处理温度60℃，处理时间2 h，pH7.0。
表3 菠萝蛋白酶嫩化马肉正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal test on tenderization conditions of horse meat with bromelain
试验号 A酶添 感官评价1 1 1 1 1 6.031 10 2 1 2 2 2 5.136 16 3 1 3 3 3 4.343 18 4 2 1 2 3 3.730 16 5 2 2 3 1 3.521 14 6 2 3 1 2 3.232 12 7 3 1 3 2 2.059 10 8 3 2 1 3 2.545 11 9 3 3 2 1 1.510 8加量 B温度 C处理时间 D pH 剪切力/ kg
表4 正交试验结果
Table 4 Range analysis of orthogonal test results
剪切力 感官评价A B C D A B C D K1j 5.170 3.940 3.936 3.687 14.667 12.000 11.000 10.667 K2j 3.494 3.734 3.459 3.476 14.000 13.667 13.333 12.667 K3j 2.038 3.028 3.308 3.539 9.667 12.667 14.000 15.000 Rj 3.132 0.912 0.628 0.211 5.000 1.667 3.000 4.333单指标优组合 A2 B3 C3 D2 A1 B2 C3 D3单指标因子主次 ABCD ADCB综合平衡主次 ABCD综合平衡优组合 A2B2C2D2或A3B2C3D2
根据正交试验的结果，对所得结论进行验证，由于在添加菠萝蛋白酶的同时，向肉中添加了一部分的水，因此对其中一个空白组注入等量的水，以此来探讨水分可能对肉嫩度产生的影响，处理一和处理二的试验条件分别为：菠萝蛋白酶添加量12 U/g，处理温度60℃，处理时间1.5 h，pH 7.0；或者菠萝蛋白酶添加量16 U/g，处理温度55℃，处理时间1.5 h，pH7.0。
试验结果（表5）表明：添加蛋白酶的处理组的剪切力值与两个空白组相比，明显减小，硬度、胶着性、咀嚼性均有显著地改善，经过嫩化处理后的马肉松软可口，鲜嫩多汁，显著提高了马肉的食用品质。
表5 菠萝蛋白酶嫩化马肉最优条件对其物性的影响
Table 5 Physical+ characteristics of horse meat with bromelain under optimum conditions
物性数据剪切力/g硬度/g胶着性/g咀嚼性/g粘着性弹性粘聚性回复性空白组 7754 3 295.087 1 831.248 1 486.756 47.979 0.812 0.556 0.200加水空白组处理方式7538 3 071.346 1 733.514 1 501.807 73.374 0.866 0.649 0.221处理一 4769 1 494.246 779.072 870.069 30.544 0.686 0.407 0.101处理二 4378 1 360.477 632.463 714.101 54.006 0.761 0.509 0.151
菠萝蛋白酶的添加量对嫩化效果的影响最为显著，随着蛋白酶添加量的增大，马肉的保水性能会显著提高，但是如果添加量过大（大于20 U/g），会出现嫩化过度的现象，虽然此时的剪切力很小，但是失水严重，马肉的外观和质地受到很大影响；处理温度对嫩化效果的影响也很显著，通过试验可知菠萝蛋白酶的最适温度在55℃～65℃之间，温度过低或过高都会影响菠萝蛋白酶的活性；处理时间对系水力和蒸煮损失率的影响较为显著，处理时间在1.5 h左右时嫩化效果较好，处理时间过短或过长，会使菠萝蛋白酶酶解作用不够或者酶解过度，因此处理时间也是影响嫩化效果至关重要的因素；菠萝蛋白酶液的pH对蛋白酶的活力也有很大的影响，当其处于pH 7.0左右时，蛋白酶的活力会有显著的提高。正交试验结果表明：菠萝蛋白酶添加量12 U/g，处理温度60℃，处理时间1.5 h，pH7.0；或者菠萝蛋白酶添加量16 U/g，处理温度60℃，处理时间2 h，pH7.0。在此条件下处理的马肉柔软细嫩、多汁，有弹性，明显改善了口感，嫩化效果很好。
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Process Optimization of Bromelain with Rolling Treatment on Horse Meat Tenderness
Abstract：Water -holding capacity，cooking loss，shear force and sensory evaluation were used as the evaluation index，by injecting bromelain and rolling treatment，studied the effects of bromelain treatment on horse meat（semitendinosus）tenderness in different bromelain dose，treatment temperature，treatment time and pH. The orthogonal test was used to get the best conditions of bromelain. The results showed that：bromelain dose，processing temperature and processing time had more significant effects on tenderness. The best conditions of bromelain were bromalain dose 12 U/g，treatment temperature 60℃，treatment time 1.5 h，pH 7.0；or bromelain dose 16 U/g，treatment temperature 60℃，treatment time 2 h，pH 7.0.
Key words：horse meat；bromelain；rolling；tenderness
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.023
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划课题“北方特色酱卤熏菜肴加工关键技术及产业化”（2014BAD04B11）
收稿日期：2014-11-14