豆粕和小麦粉挤出物的制曲工艺参数对淀粉酶活力的影响

马成业，何媛媛，白兴达，李宏军*
（山东理工大学农业工程与食品科学学院，山东淄博255049）

摘　要：以豆粕和小麦粉的挤出物为原料，以淀粉酶活力为考察指标，以制曲温度、麸皮比例、润水量和制曲时间为制曲参数，采用四因素进行五水平二次旋转正交试验，使用SAS9.1软件进行试验数据处理，得出最佳制曲工艺参数为：制曲温度30.0℃，麸皮比例30.0 %，润水量100.0 %，制曲时间60.0 h。在此条件下豆粕和小麦粉挤压膨化物种曲的淀粉酶活力为587 U/g。

酿造酱油是以大豆或豆粕等植物蛋白为主要原料，辅以小麦粉、小麦、麸皮等淀粉质原料，经过米曲霉（Aspergillus oryzae）为主的微生物发酵作用，生产出的一种含有多种氨基酸、碳水化合物、酯类、醇类等多种物质且具有特殊色、香、味的调味品[1-2]。酱油生产是微生物生长代谢中产生的多种酶对原料进行复杂的生化反应的总和结果，主要表现为对蛋白质和淀粉的水解作用[3]。制曲是酱油生产的基础，实质是创造曲霉的适宜生长条件，促进曲霉充分发育繁殖，减少有害微生物的繁殖，并分泌发酵过程中所需酶类的过程[4]，降解糖类和蛋白质[5]。酱油的甜味主要来自酱油中的糖类，从中分离出的有葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和麦芽三糖等[6]。淀粉原料降解的糖类产物不仅是酱油甜味的主要来源，还为酱醪发酵过程中微生物糖酵解奠定了物质基础，对酱油的色、香、味、体的形成有着十分重要的作用。从而使蛋白质降解成肽类和氨基酸[7]，淀粉酶等可以使发酵过程中酵母等微生物获得更多的碳源，使糖代谢的强度适度加强，从而产生芳香物质。糖化作用生成的单糖类除了葡萄糖外，还含有果糖及五碳糖。酱油色泽主要是由糖分与氨基酸结合而成。酒精发酵也需要糖分。糖化作用完全，则酱油的甜味好，体态浓厚，无盐固形物含量高，可明显提高酱油的质量[8]。淀粉酶活力是衡量制曲质量优劣的一种重要指标，曲霉所产淀粉酶主要有α-淀粉酶、淀粉1，4-葡萄糖苷酶、β-淀粉酶、淀粉1，6-糊精酶和麦芽糖酶等，这些酶关系着原料的利用率，而且据报告淀粉酶有一定的耐盐性，对发酵时的温度范围也较蛋白酶不敏感，这有利于酱油发酵后期淀粉酶继续作用，将酱油原料中的淀粉质在淀粉酶催化作用下分解成醇、醛酸等小分子，对酱油风味有很大影响[9-10]。

本研究的主要目的是以豆粕和小麦粉的挤出物为原料，以淀粉酶活力为考察指标，以制曲温度、麸皮比例、润水量和制曲时间为制曲参数，优化豆粕和小麦粉混合物的最佳制曲工艺参数。

1　材料与方法

1.1　材料和设备

豆粕（市购，济宁华正油脂有限公司）；小麦粉（淄博面粉厂提供）；麸皮（淄博面粉厂提供）；米曲霉（沪酿3.042，山东巧媳妇食品有限公司提供）。

单螺杆挤压试验台为山东理工大学自制，生产效率为100 kg/h，它由组合套筒和螺杆组成，螺杆转速为0～1200 r/min无级可调。套筒温度为0℃～300℃连续可调，配有温度数显仪表闭环自控系统，挤压机模孔孔径（6.0 mm～16.0 mm）有级可调。

按小麦粉∶豆粕=14∶100的质量比例进行调配，调整小麦粉和豆粕混合物的水分质量分数为23 %，之后进行挤压；挤压机套筒温度为130℃、螺杆转速为200 r/min、模孔孔径为10 mm。挤出物冷却、粉碎待用。

在此条件下豆粕和小麦粉挤压膨化物的蛋白质消化率为87.21 %、蛋白质NSI值为43.25 %、淀粉糊化度为98.26 %。

以米曲霉作为种子，制作三角瓶种曲。每组原料中各接入1 %三角瓶种曲。接种后于33℃培养箱中培养16 h后菌丝布满表面，原料结块，进行第1次翻曲，以后每6 h翻曲1次，40 h达产酶高峰，此时出曲。称取5 g，充分研细，加水100 mL置于40℃水浴中，间断搅拌1 h，过滤，滤液用0.1 mol/L pH 7.2磷酸缓冲液稀释20倍，测淀粉酶活力。

1.4　淀粉酶活力测定

淀粉酶活力测定：碘量法[11]。

2　结果与讨论

米曲霉（沪酿3.042）酶系复杂，分泌的胞外酶有：中性蛋白酶、碱性蛋白酶、淀粉酶、糖化酶[12]。淀粉酶等活力的增加可以使发酵过程中酵母等微生物获得更多的碳源，使糖代谢的强度适度加强，从而增加芳香物质的产生，总酯含量相应增加[13]。曲霉在生长繁殖时需要糖分和氨基酸作为养料，并通过呼吸作用将糖分分解成二氧化碳和水，同时产生大量的热。米曲霉分泌的淀粉酶能切断淀粉链内部的1，4-葡萄糖苷键生成大分子糊精及少量的葡萄糖和麦芽糖[14]。葡萄糖是米曲霉、酵母菌及其他微生物的碳源营养，也是酒精发酵、乳酸发酵及谷氨酸发酵的基础物质，还能与氨基酸化合成有色物质。所以，淀粉的糖化程度对酱油色、香、味、体均有重大影响。糖化作用彻底，酱油的甜味好，体态浓厚，无盐固形物含量高，可大大提高酱油质量[15]。

考虑试验设备条件，结合以往文献及预备试验的结果，选定制曲温度x1（℃）、麸皮比例x2（%，质量）、润水量x3（%，质量）、制曲时间x4（h）为主要考察因素[16]，采用二次正交旋转组合设计安排试验，以淀粉酶活力为考察指标运用响应面法安排试验，因素水平编码表如表1所示[17]，方案如表2所示。

利用SAS9.1软件对试验结果进行分析，得出回归方程，然后对回归方程进行方差分析和显著性检验，以检验该回归方程是否拟合真实试验结果。最后对所得数据做岭回归分析，得出最佳制曲工艺参数。

2.1　淀粉酶活力回归模型的建立和检验

用SAS9.1软件处理表2中的试验数据，并建立回归模型，并对回归模型进行检验。

回归模型方差分析表（如表3所示）表明，淀粉酶活力模型的决定系数为0.872 9，响应模型线性回归不显著，二次项回归极显著，交互项回归不显著，总回归（P＜0.000 1）极显著；失拟项不显著的。

2.2　制曲参数对淀粉酶活力的影响

微生物生长必需有适量的水，水是细胞组成部分，也是细胞吸收营养物质和排泄代谢产物的介质。润水量对淀粉酶活力的影响见图1。

试验因素在低水平时，淀粉酶活力的活力随着润水量的增加而升高[19]，在润水量维持在100.0 %时达到最大值。然后随着润水量的增加淀粉酶活力开始下降。原因是当润水量过低时，种曲中水分不足以提供米曲霉正常的生长繁殖；水分含量较高时，降低了底物的孔隙度，限制了热量的传递，酶的活性较低[20]。当润水量为130.0 %时，曲料明显过湿，米曲霉孢子发芽明显受到抑制，甚至有酸味产生，可见100.0 %的加水量是适宜米曲霉生长的较大加水量。适量的水分可促进米曲霉的发芽和生长，从而有利于各类酶系的提高；制曲时如果水分较低，曲霉生长不充分，酶活则偏低；如果水分过高，则会使曲霉在繁殖过程中消耗的糖分增加，从而使杂菌繁殖加快，可能会导致曲料变质。

挤压原料的组成影响种曲的生长，进而影响淀粉酶的活力。利用淀粉酶，原料中使用麸皮是较适宜的[21]。水分的比例对产酶影响最大，其次是麸皮的比例，麸皮添加比例为30.0 %时淀粉酶活力较高。

麸皮比例对淀粉酶活力的影响见图2和图3。

随着麸皮比例的增加淀粉酶的活力先升高后降低，当麸皮比例为30%达到最大值。当麸皮比例低时，种曲内空隙小，溶氧效果不好，不利于米曲霉生长；麸皮比例过高时，米曲霉生长所需氮源不足，影响米曲霉生长。

制曲温度对淀粉酶活力的影响见图4。

温度过低或过高都会影响发芽和生长速度，低于28.0℃孢子发芽缓慢，对低温型微球菌、青霉、毛霉菌等杂菌容易生长[22]。制曲温度过高时，米曲霉生长能力弱，淀粉酶活力低。生产中应尽量控制在30.0℃～35.0℃，以40.0℃为极限，否则易造成烧曲[23-24]。高于35℃枯草芽孢杆菌，根霉等耐高热性微生物容易生长繁殖，产生氨味，使曲料发黏。

制曲时间对淀粉酶活力的影响见图5和图6。

当制曲时间延长到60.0 h达到最大值后又有下降趋势。当制曲时间较短时，米曲霉进入产酶时间短，产酶量少，当制曲时间长时，米曲霉开始衰老，部分酶失活。制曲后期，随着时间的延长，米曲霉逐渐衰老，产酶速率下降，部分淀粉酶活性下降，时间太长，制曲消耗的营养成分也较多，淀粉酶酶活力升高缓慢[25]。

制曲过程中温度与曲霉孢子的发芽、菌丝的生长，曲霉的呼吸代谢、出曲时的酶活、混入微生物的增殖有密切关系，因此制曲温度是制曲技术条件中最重要的因子。淀粉酶的产生最适温度为30℃～38℃左右。温度越高，菌株生长越旺盛，淀粉酶活越高，生成大量葡萄糖。

在酱油酿造过程中酱油曲中的酶活实际上呈现一定的多样性，蛋白酶在其中发挥着主要作用，其他的酶也对酱油生产起着作用，淀粉酶影响着淀粉质成分的分解，进而影响着糖类的产生，最终对酱油风味和色泽有影响。淀粉酶能切断在淀粉链内部的1，4-葡萄糖苷键，生成大分子糊精及少量的麦芽糖和葡萄糖。葡萄糖苷酶能从非还原端开始水解直链淀粉、糊精等，能将它们逐个地水解成为葡萄糖分子[26]。在糖化作用下，除生成葡萄糖外，还能生成果糖及五碳糖。淀粉的糖化降解提供了大曲培养过程中米曲霉生长所需能量，提供了酵母菌和乳酸菌生长和发酵的能量和底物，提供了Maillard反应中的还原糖。在淀粉降解过程中生成的葡萄糖、麦芽糖和糊精可以为酱油提供甜味[27]。

2.3　采用统计选优寻求最佳制曲挤压参数

用岭回归寻找最优工艺范围，以淀粉酶活力为考察指标，经过岭回归寻优得出最佳制曲工艺参数范围为：制曲温度（x1）为30.9℃～31.9℃，麸皮比例（x2）为28.9 %～29.0 %，润水量（x3）为117.8 %～119.8 %，制曲时间（x4）为59.9 h～60.0 h，在此条件下淀粉酶活力为587 U/g。2.4验证试验与对照试验

由于试验目的是得到较高的淀粉酶活力，综合选择以下参数进行验证试验和对照试验，对照是以蒸煮法处理原料进行的，结果如表4所示。

通过验证和对照试验可知：在上述工艺条件下物料的淀粉酶活力符合岭回归寻优结果，而且试验指标均优于对照试验的结果。

由于豆粕和小麦粉经挤压膨化处理后体积增大，结构疏松，大豆蛋白变成弹性良好的海绵状组织，透气性良好；同时淀粉糊化，利于淀粉酶的作用[28]；经挤压膨化后的谷物，蛋白质的结构发生变化，水溶性增大，水不溶性物减少，为微生物的生长繁殖提供了营养保证[29]，有利于菌丝的生长，因而成曲的酶活力高[30]。

3　　结论

使用挤压豆粕和小麦粉为原料，由于良好的海绵状组织、高糊化度和良好的透气性，制曲时利于霉菌菌丝向原料内部生长，淀粉酶活力高。以淀粉酶活力为考察指标，安排四因素五水平正交旋转组合试验，得出最佳制曲工艺参数为：制曲温度为30.0℃，麸皮比例为30.0 %，润水量为100.0 %，制曲时间为60.0 h。在此条件下豆粕和小麦粉挤压膨化物种曲的淀粉酶活力587 U/g。

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Inlfuence of Parameters of Koji-Making with Extruded Mixture of Soybean Meal and Wheat Flour to Amylase Activity

MA Cheng-ye，HE Yuan-yuan，BAI Xing-da，LI Hong-jun*
（School of Agricultural and Food Engineering，Shandong University of Technology，Zibo 255049，Shandong，China）

Abstract：The paper used extruded mixture of soybean meal and wheat flour as material to make koji for soybean sauce. The amylase activity was taken as the indexes. The method of the quadratic orthogonal rotating combination design of four factors（the temperature，the proportion of bran，the moisture and the time of making koji）and five levels was used. The optimized parameters of making koji was abtained by SAS 9.1. The temperature was 30.0℃，the proportion of bran was 30.0 %，the moisture was 100.0 % and the time of making koji was 60.0 h. The amylase activity was 587 U/g.

基金项目：国家自然科学基金项目（31471676）；山东省科技发展计划项目（2013GSF12018）；山东理工大学青年教师发展支持计划（4072-112010）

作者简介：马成业（1978—），男（汉），副教授，博士，研究方向：农产品贮藏与加工。

*通信作者：李宏军（1968—），男，教授，研究方向：食品科学。

豆粕和小麦粉挤出物的制曲工艺参数对淀粉酶活力的影响

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

1　材料与方法

2　结果与讨论

3　　结论