表1 复合酶D-最优混料设计试验因素水平表
Table 1 Coded factors and their coded levels in D-optimal mixture design
因素 水平值/% 编码纤维素酶 0.500 0.000 0.700 0.667果胶酶 0.400 0.000 0.600 0.667漆酶 0.600 0.000 0.800 0.667
摘 要：以绿茶为原料，采用纤维素酶、果胶酶和漆酶组成的复合酶提取绿茶中的茶氨酸，并采用D-最优混料设计优化提取工艺。由建立的数学模型可知，复合酶提取茶氨酸的最佳工艺条件为茶叶浓度100 g/L，纤维素酶添加量0.657 %，果胶酶添加量0.543 %，漆酶添加量0.600 %，酶解pH 5.6、酶解温度50℃，酶解时间2 h。经过验证试验可知，在最优酶法提取工艺条件下茶氨酸的提取率可达到极大值0.421 %。
关键词：复合酶；茶氨酸；混料设计
茶氨酸是茶叶中特有的非蛋白质氨基酸，因其具有抗肿瘤、舒缓神经和增强免疫力等多种活性，在功能食品方面具有很大的应用前景[1-2]。目前生产茶氨酸的方法主要有化学合成法、微生物发酵法及茶叶提取法等。化学合成法虽具有成本低、产率高等优点，但存在产物难于提纯、工艺污染大等问题；微生物发酵法虽有较成熟的实验室技术，但工业化生产核心技术仍未有效解决；传统的茶叶提取法受到在茶叶中茶氨酸提取率不高的因素制约，也难于产业化[3-6]。
酶工程技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项新型生物工程技术。茶叶细胞内存在着纤维素、半纤维素和果胶等成分，是胞内氨基酸等成分溶出的主要屏障。果胶酶、纤维素酶及漆酶可分别降解茶叶中的果胶、纤维素及木质素等成分，显著加速胞内物的释放，提高茶氨酸的提取率，弥补了传统提取法的不足[7]。
本试验采用D-最优混料设计的方法考查复合酶（纤维素酶、果胶酶、漆酶）配比对酶法提取茶氨酸提取率的影响，并对茶氨酸复合酶法提取工艺进行优化。
1.1 材料和仪器
炒青绿茶：市售，50℃烘干粉碎，过40目筛；三氯乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；纤维素酶（酶活1.5×104U/g）、果胶酶（酶活5.0×104U/g）：美国Sigma公司；漆酶（酶活1.5×104U/g）：丹麦Novo公司。
FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；BGZ-146型电热真空干燥箱：上海博迅实业有限公司；TGL-16型台式高速冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；SHZ-B95型循环水式真空泵：河南爱博特科技发展有限公司；LC-20A液相色谱仪：岛津国际贸易（上海）有限公司。
1.2 方法
1.2.1 茶氨酸提取工艺流程
10 g茶叶（粉碎）→加入100 mL水→70℃水浴处理10 min→按不同比例添加复合酶（以百分比计，质量比）→pH 5.6、50℃浸提2 h→4层纱布过滤→滤液加入10 %三氯乙酸（沉淀蛋白质、多糖组分），涡旋混匀后静置20 min→8 000 r/min离心10 min→上清液50℃减压浓缩，真空干燥至恒重→游离茶氨酸粗品。
1.2.2 试验设计
在预试验的基础上，确定了3种酶的用量限度分别为：纤维素酶X1（0.5 %～0.7 %）、果胶酶X2（0.4 %～0.6 %）及漆酶X3（0.6 %～0.8 %），复合酶总添加量为1.8 %。试验选取三因素D-最优混料设计，以茶氨酸提取率Y（%）为考察指标，应用Design-Expert 8.05版试验数据分析软件对数学模型（Scheffe多项式）进行拟合分析，判断并选取最佳回归模型[8]。试验安排及结果见表1。
表1 复合酶D-最优混料设计试验因素水平表
Table 1 Coded factors and their coded levels in D-optimal mixture design
因素 水平值/% 编码纤维素酶 0.500 0.000 0.700 0.667果胶酶 0.400 0.000 0.600 0.667漆酶 0.600 0.000 0.800 0.667
1.2.3 茶氨酸含量的测定
茶氨酸含量的测定采用高效液相色谱法[9]。
2.1 单因素试验
2.1.1 纤维素酶添加量对茶氨酸提取效果的影响
纤维素酶可有效降解茶叶细胞壁产生高葡萄糖聚合物及葡萄糖，可显著地加速胞内物的释放，提高茶氨酸的提取率。纤维素酶添加量对茶氨酸提取效果的影响如图1所示。
图1 纤维素酶添加量对茶氨酸提取效果的影响
Fig.1 The effects of cellulase concentration on the extraction rate of theanine
由图1可以看出，随着纤维素酶添加量的增加，茶氨酸浸提得率不断提高，当纤维素酶的添加量达到0.70 %，茶氨酸提取率达到最高。
2.1.2 果胶酶添加量对茶氨酸提取效果的影响
在茶叶细胞内存在的高含量的果胶质，是胞内氨基酸等成分溶出的主要屏障。添加果胶酶可以水解果胶质，促进细胞内含物流出，使茶氨酸氨基酸类物质得到有效地释放。果胶酶添加量对茶氨酸提取效果的影响如图2所示。
图2 果胶酶添加量对茶氨酸提取效果的影响
Fig.2 The effects of pectinases concentration on the extraction rate of theanine
由图2可以看出，随着果胶酶浓度的提高，茶氨酸的提取率也相应升高。当果胶酶的添加量为0.60 %时，茶氨酸溶出基本达到平衡。
2.1.3 漆酶添加量对茶氨酸提取效果的影响
漆酶添加量对茶氨酸提取效果的影响如图3所示。
图3 漆酶添加量对茶氨酸提取效果的影响
Fig.3 The effects of laccase concentration on the extraction rate of theanine
由图3可以看出，当漆酶的添加量达到0.80 %时，茶氨酸提取率达到最高。但随着漆酶添加量的继续增加，茶氨酸提取率反而降低。这是因为漆酶具有很强的催化活性，过高的漆酶浓度促进了茶氨酸发生酶促反应，发生沉淀，茶氨酸随茶叶渣一起被过滤，总体上降低了茶氨酸的提取得率。
2.2 混料试验设计与结果
以纤维素酶、果胶酶和漆酶的用量为自变量，以茶氨酸提取率为因变量，通过D-最优混料设计，利用选取的试验点组成16个试验组合，以此确定复合酶的最优配比，试验方案及结果见表2。
表2 混料设计试验安排和茶氨酸提取率试验结果
Table 2 Arrangement and experimental results of composite design
试验号X1纤维素酶/% X2果胶酶/% X3漆酶/% Y茶氨酸提取率/% 1 0.606 0.502 0.693 0.412 2 0.559 0.581 0.660 0.406 3 0.700 0.400 0.700 0.365 4 0.549 0.451 0.800 0.347 5 0.700 0.500 0.600 0.418 6 0.606 0.502 0.693 0.407 7 0.629 0.400 0.771 0.378 8 0.500 0.600 0.700 0.401 9 0.606 0.502 0.693 0.412 10 0.500 0.505 0.795 0.355 11 0.600 0.600 0.600 0.412 12 0.500 0.600 0.700 0.403 13 0.600 0.600 0.600 0.413 14 0.550 0.511 0.740 0.381 15 0.676 0.462 0.662 0.407 16 0.700 0.500 0.600 0.417
以茶氨酸提取率为响应值，应用Design-Expert对上述试验数据进行多元回归拟合分析，各因素对响应值的影响可用如下多元回归方程表示为：Y = 0.16X1+ 0.31X2+ 0.29X3+ 0.81X1X2+ 0.63X1X3+ 0.33X2X3-1.20X1X2X3+ 0.39X1X2（X1- X2）+ 0.31 X1X3（X1- X3）+ 0.30X2X3（X2- X3）。
由回归方程可知，三个二次项的系数均为正数，表明该三个交互项对茶氨酸提取率的提高都起着促进作用。由回归方程可知，三个二次项的贡献作用大小依次为X1X2＞X1X3＞X2X3，表明在复合酶中纤维素酶和果胶酶的复合起着较为主要的作用。这主要是由于茶叶中的半纤维素、纤维素及木质素的表面上覆盖着果胶类物质，果胶酶可有效作用于茶叶细胞壁中的果胶，破坏果胶和半纤维素等组成的无定形结构，果胶屏障的降解有利地促进了纤维素、纤维素及木质素的水解。纤维素酶主要作用于茶叶细胞壁中的纤维素，对细胞壁起破坏作用，漆酶可有效降解木质素和半纤维素支链网状交联结构中的酯键，协同纤维素酶进一步破坏茶叶细胞壁。
2.3 数据的方差分析及优化验证
利用F检验对表2中的试验结果和回归模型的统计学显著性和方差进行分析，分析结果见表3。
回归方程多元相关系数R2=0.997 5，校正决定系数R2adj=0.993 6，说明该模型对茶氨酸实际提取工艺拟合较好；模型线性混合项和二次项均显著，说明试验所选用的模型具有高度的显著性，失拟项在P=0.05水平上不显著，因此该模型的拟合程度较好，可以用此模型来确定复合酶的配比。
表3 回归方程的方差分析
Table 3 Variance analysis for the established regression equation
注：**表示极显著（P＜0.01）；*表示显著（0.01＜P＜0.05）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F显著性拟合模型 7.969×10-3 9 8.855×10-4260.86＜0.000 1 **混合线性模型 5.854×10-3 2 2.927×10-3862.23＜0.000 1 ** AB 3.561×10-4 1 3.561×10-4104.90＜0.000 1 ** AC 3.362×10-4 1 3.362×10-4 99.04＜0.000 1 ** BC 1.024×10-4 1 1.024×10-4 30.15 0.001 5 * ABC 2.290×10-4 1 2.290×10-4 67.47 0.000 2 * AB（A-B） 1.499×10-4 1 1.499×10-4 44.15 0.000 6 * AC（A-C） 7.714×10-5 1 7.714×10-5 22.73 0.003 1 * BC（B-C） 3.468×10-5 1 3.468×10-4 10.22 0.018 7残差 2.037×10-5 6 3.395×10-6失拟项 7.006×10-7 1 7.006×10-7 0.18 0.690 5纯差 1.967×10-5 5 3.933×10-6总离差 7.990×10-3 15 R2 0.997 5 R2adj 0.993 6
在确定的3种酶制剂的添加范围内，通过设定期望响应值Y的范围（表4），从随机组合开始进行最陡爬坡预测，预测目标响应值的最大值。为对比复合酶提取效果，试验以常规水提法作为对照组，实施数据分析结果、预测值及相关试验验证值见表5。
表4 试验因素和响应值的目标范围
Table 4 Range of the test and response value
类型 纤维素酶/% 果胶酶/% 漆酶/%茶氨酸提取率/%目标 范围内 范围内 范围内 最大值下限 0.500 0.400 0.600 0.347上限 0.700 0.600 0.800 10.000
表5 复合酶最佳组合的预测和实测结果
Table 5 The predicted and measured results of the best combination of different ingredients
注：-表示对照组试验无预测提取率。
实测提取率/% 1 0.657 0.543 0.600 0.437 9 0.421 2 0.650 0.550 0.600 0.437 4 0.417 3 0.600 0.500 0.700 0.406 2 0.398 4 0.500 0.600 0.700 0.401 9 0.403对照1 0.000 0.000 0.000 - 0.283对照2 0.000 0.000 0.000 - 0.287对照3 0.000 0.000 0.000 - 0.279组别 纤维素酶/% 果胶酶/% 漆酶/% 预测提取率/%
通过对比试验预测值和实测值可以发现，茶氨酸的实际提取率与预测提取率基本一致，所有预测点中最高值为0.421 mg/g，最佳点对应的复合酶配比为：纤维素酶0.657 %，果胶酶0.543 %，漆酶0.600 %，在此条件下，茶氨酸复合酶法提取工艺的提取率与常规的水提法相比提高了48.8 %，具有明显优越性。
茶叶细胞壁的主要组成成分是果胶、纤维素、半纤维素及木质素，本试验采用纤维素酶、果胶酶及漆酶复合酶降解茶叶细胞壁，促进茶氨酸的提取。试验发现，不同配比的复合酶配比对茶氨酸的提取率有着较大的影响。
D-最优混料设计是一种受条件约束的回归设计，具有设计试验点数少，回归模型预测精度高等优点，本试验为避免混料条件的限制而引起信息矩阵退化，采用了特殊Scheffe多项式数学模型进行回归分析，建立了预测模型，确定最优的复合酶配比为纤维素酶添加量0.657 %，果胶酶添加量0.543 %，漆酶添加量0.600 %。根据预测的比值进行验证试验，证明了该试验方法的高效性和准确性，非常适合解决复合酶配比的问题。
参考文献：
[1]帅玉英,沈宇峰,黄海娟,等.功能性配料L-茶氨酸的生产应用与法规情况简介[J].中国食品添加剂,2013(2):181-185
[2]唐颢,唐劲驰,凌彩金,等.茶氨酸的制备与生理活性研究进展[J].中国茶叶, 2010,32(1):18-21
[3]傅锦坚.微生物酶法生产茶氨酸的研究[D].广州:广东药学院, 2009
[4]陈沛鑫,高英,李卫民.正交试验优选茶梗中茶氨酸的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2012, 18(17):39-41
[5]忻寅强,鲁昌燕,王期,等.生物酶法合成L-茶氨酸和聚谷氨酸的高效同步分离纯化[J].南京师大学报(自然科学版),2011(2):90-93
[6]张飞,王丽娟,刘寅,等.离子交换法提取酶促转化液中的L-茶氨酸[J].食品工业科技, 2012, 33(15):251-253
[7]龚玉雷,魏春,王芝彪,等.生物酶在茶叶提取加工技术中的应用研究[J].茶叶科学, 2013, 33(4):311-321
[8]关颖男.混料试验设计[M].上海:上海科技出版社,1980:135-139
[9] WANG Lin, XU Renjie, HU Bing, et al. Analysis of free amino acids in Chinese teas and flower of tea plant by high performance liquid chromatographycombinedwithsolid-phaseextraction[J].FoodChemistry, 2010, 123: 1255-1266
欢迎订阅2016年《食品研究与开发》
《食品研究与开发》是由天津市食品研究所有限公司和天津市食品工业生产力促进中心主办，国内外公开发行的食品专业科技期刊，于1980年创刊，现为半月刊，采用国际流行开本大16开。其专业突出，内容丰富，印刷精美，是一本既有基础理论研究，又包括实用技术的刊物。本刊已被“万方数据库”、“中文科技期刊数据库”、《乌利希期刊指南》、美国《化学文摘》、英国国际农业与生物科学研究中心（CABI）等知名媒体收录，并被列入“中文核心期刊”、“中国科技核心期刊”、RCCSE中国核心学术期刊（A）。主要栏目有：基础研究、分离提取、食品研发、工艺技术、天然产物、检测分析、生物工程、营养保健、贮藏保鲜、质量安全、专题论述、食品机械等。
本刊国内统一刊号CN 12-1231/TS；国际刊号ISSN 1005-6521；邮发代号：6-197。全国各地邮局及本编辑部均可订阅。从本编辑部订阅全年刊物享八折优惠。2016年定价：30元/册，全年720元。
本编辑部常年办理邮购，订阅办法如下：
（1）邮局汇款。地址：天津市静海县静海经济开发区南区科技路9号；收款人：《食品研究与开发》编辑部；邮政编码：301600。
（2）银行汇款。开户银行：工商银行静海支行
账号：0302095119300204171；单位：天津市食品研究所有限公司。
《食品研究与开发》编辑部
E-mail：tjfood@vip.163.com
电话（传真）：022-59525671
Mixed Design Optimization of Extraction of Theanine with Compound Enzyme
Abstract：Cellulase，pectinases and laccase were simultaneously used for the extraction of theanine from green tea in the present study，and the extraction process was optimized by D-optimal mixture design. On the basis of establishing mathematical model，the optimal extraction conditions for theanine were a material/liquid ratio of 100 g/L，extract at pH 5.6，55℃and for 2 h with 0.657 % cellulase，0.543 % pectinases and 0.600 % laccase. Under these conditions，a maximum total pectinases yeild efficiency of 0.421 % was observed by the verification test.
Key words：compound enzyme；theanine；mixed design
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.016
收稿日期：2014-11-07