摘 要：采用超声波辅助酶法提取橘皮黄酮，探讨了酶解温度、酶液用量、酶解时间和缓冲液pH对黄酮提取率的影响，并通过响应面法建立二次回归模型对提取工艺进行优化。红外光谱分析显示，提取物为典型的黄酮类化合物。响应面法优化结果表明，使用300 W功率超声波预处理20 min后，在酶解温度52℃、酶液用量0.96 %、酶解时间90 min和缓冲液pH为4的条件下，黄酮的提取量可达到5.82 %。
关键词：橘皮黄酮；酶法提取；超声波辅助；响应面优化
橘皮是丰富廉价的果实废弃物，其中除了含有丰富的芳香油、果胶、色素外，还有经济价值很高的橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等生物类黄酮物质[1-2]，橘皮中的黄酮类化合物具有多种生物活性，在抗菌、抗氧化、抗突变、消炎、降压、清热解毒以及抑制脂肪氧化酶等方面效果显著[3]，广泛用于医药、食品及美容等行业。
在橘皮黄酮传统的提取方法中多采用溶剂提取法，但时间长、纯度及活性低。而酶法提取技术与超声波辅助提取法在许多方面发挥着独特的优势。其中酶法提取条件温和、能耗低、无污染[4]，但提取速度慢。而超声波在水等介质中具有良好穿透性，可以产生扩散、击碎和搅拌等多种作用，可增强溶剂渗透力，从而提高产率、缩短时间、避免高温对提取物生物活性的影响[5]。因此，采用超声波辅助酶法提取技术，可以在低温环境下加速胞内物质溶出，节省提取时间、加快反应速率和提高产率。
目前，关于利用超声波辅助酶法提取橘皮黄酮的研究报道还不多见。本研究以橘皮为原料，采用超声波辅助酶法联用技术提取橘皮黄酮，并采用响应面法对提取工艺进行优化，以获取最佳的提取工艺。
1.1 原料与设备
橘皮：从水果市场购得；芦丁标准样品：美国Sigma公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。
FQ-ⅡD超声波细胞粉碎机：中国四川新科；SMA4000紫外分光光度计：美国Merinton；HH-S4数显恒温水浴锅：中国江苏金坛友联；WD9419电动粉碎机：中国北京六一；Varian 2000傅立叶变换红外光谱仪：美国Varian。
1.2 方法
1.2.1 橘皮预处理
用蒸馏水将橘皮洗净后放入鼓风干燥箱，在70℃恒温干燥4 h，再用用电动粉碎机破碎至50目。取橘皮粉末2.0 g，按1∶20（g/mL）的料液比加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液后置于超声波细胞粉碎机中，根据王梅英等[6]的研究结果，在300 W的功率下处理20 min后冷却至45℃，得到预处理液。
1.2.2 橘皮黄酮的提取
在预处理液中加入一定质量分数的纤维素酶，调节缓冲液pH，置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，在一定的温度下提取一定时间，再冰浴冷却至常温，然后减压、抽滤，得到橘皮黄酮提取液。同时，采取溶剂提取法下进行对比试验。
1.2.3 橘皮黄酮的分析
样品总黄酮含量的测定参照参考文献[7]方法进行。
黄酮提取率按照（1）式计算：黄酮提取率/%
2.1 单因素试验
在探索性试验的基础上，以橘皮黄酮的提取率为指标，采用单因素试验，考察酶解温度、酶液用量、酶解时间和缓冲液pH对黄酮提取率的影响，以确定提取黄酮的最佳条件。
2.1.1 酶解温度和酶液用量对提取率的影响
根据探索性试验的结果，选取在酶解时间90 min和缓冲液pH为4的条件下进行试验，不同酶解温度和酶液用量对橘皮黄酮提取率的影响见图1。
当酶液用量为0.8 %、提取温度小于50℃时，随着温度升高，橘皮黄酮的提取率逐渐增加，并在50℃时达到5.55 %；但当温度继续升高，提取率增加不明显。因此在本试验中选取50℃为酶法提取温度。在50℃时，酶液用量低于0.8 %时，随着酶液用量的增加，橘皮黄酮提取率明显增加，当酶液用量超过此值时，黄酮提取率增加缓慢。
图1 酶解温度和酶液用量对提取率的影响
Fig.1 Effects of enzyme extraction temperature and enzyme dosages on flavone extraction yield
2.1.2 缓冲液pH和酶解时间对提取率的影响
选取酶解温度50℃、酶液用量0.8 %，考察不同酶解时间和缓冲液不同pH对黄酮提取率的影响，结果如图2所示。
图2 缓冲液pH和酶解时间对提取率的影响
Fig.2 Effects of pH of buffer and enzyme extraction time on flavone extraction yield
在酶解时间为90 min、缓冲液pH为4左右时的橘皮黄酮提取率较高，而pH低于或超过4后均较小。这可能是由于pH为4左右时酶的活性较好的缘故，因此确定pH为4。由图2还可知：随着提取时间的延长，黄酮提取率逐渐增加，当酶解时间超过90 min后再延长提取时间，对提取率影响不明显。考虑提取成本，选择90 min作为酶解时间。
2.2 响应面分析
2.2.1 响应面试验设计
为了使提取工艺更加科学，在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken设计原则[8]，选取酶解温度、酶液用量和酶解时间对黄酮得率影响较显著的3个因素，以橘皮黄酮的提取率为响应值，设计如表1所示的三因素三水平响应面试验；响应面试验结果如表2所示。
2.2.2 二次多元回归模型分析
运用Design-expert软件对上述数据进行二次多元回归拟合得到二次多元回归方程（2）：
表1 响应面设计中的水平和编码
Table 1 Level and coding of response surface design
变量 编码 编码水平-1 0 1酶液用量/% A 0.6 0.8 1.0酶解时间/min B 80 90 100酶解温度/℃ C 45 50 55
表2 响应面设计和试验结果
Table 2 Response surface design and experimental result
试验号酶液用量/%酶解时间/min酶解温度/℃黄酮提取率/% 1 0.8 80 50 3.57 2 1.0 80 50 3.60 3 0.8 100 50 4.79 4 1.0 100 50 5.65 5 0.8 90 45 3.85 6 1.0 90 45 4.71 7 0.8 90 55 4.92 8 1.0 90 55 5.78 9 0.9 80 45 3.60 10 0.9 100 45 3.77 11 0.9 80 55 3.76 12 0.9 100 55 5.56 13 0.9 90 50 5.57 14 0.9 90 50 5.72 15 0.9 90 50 6.04
分析结果如表3所示。
表3 模型与方差
Table 3 Model and variance
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 12.20 9 1.36 16.25 0.003 4 显著A-酶液用量 0.85 1 0.85 10.21 0.024 1 B-酶解时间 3.43 1 3.43 41.14 0.001 4 C-酶解温度 2.09 1 2.09 25.06 0.004 1残差 0.42 5 0.08失拟项 0.30 3 0.10 1.75 0.384 4 不显著纯误差 0.12 2 0.06复相关系数R2=0.966 9
模型的F值为16.25，P值0.003 4＜0.05，表现为“显著”；“失拟相”为0.384 4，表现为“不显著”，复相关系数R2=0.966 9接近1，说明该方程拟合度好，模型精度高。交互项BC显著，表明酶解时间和温度的交互作用对橘皮黄酮提取率有显著影响。同时，二次项系数为负值，表明有最佳值存在。
响应面三维模型如图3所示。
图3 响应面三维模型
Fig.3 3D model of response surface
酶解温度和酶解时间的交互作用对橘皮黄酮得率的影响非常明显：当其中某因素固定时，随着其它因素值的增加，黄酮的提取量增加迅速，达到峰值后有所降低，这是因为：由于升高温度能够提高反应体系的活化能进而提高反应速度，但太高的温度又会使酶液失活[9]。而随着酶解时间的延长，黄酮被氧化的机率增加，从而导致提取量下降。从图3中还可见，随着酶液用量的增加，黄酮提取量增幅减缓，这可以解释为随着酶的浓度的升高，与底物的接触量增大，酶解反应速率增大。但酶液的浓度达到一定量时，过量的酶难以发挥作用所致[10]。
运用响应面模型对工艺进行优化，得到最佳工艺为：酶液用量、酶解时间和酶解温度分别为0.96 %、91.24 min和52.26℃，橘皮黄酮的提取量达到最大值6.05 %。选取酶液用量0.96 %、酶解时间90 min和酶解温度52℃进行验证性试验，3次试验黄酮的平均提取量为5.82 %，与理论计算值仅相差0.23 %，这说明在本试验条件下所建立的回归模型具有较高的准确性。而在同等条件下无超声波辅助提取的仅有3.87 %，显然比采用超声波辅助的要低很多。
2.3 红外光谱分析
由于天然黄酮类化合物母核上常含有烃氧基、甲氧基、异戊烯氧基和羟基等基团，其红外光谱在3100 cm-1～3 500 cm-1、1 610 cm-1～1 650 cm-1，以及1 372、1 244、1 061 cm-1的振动峰可代表黄酮类化合物的特征峰。
橘皮黄酮红外谱如图4所示。
图4 产物的红外光谱图
Fig.4 FT-IR spectra of the extraction
3 400 cm-1附近有羟基缔合形成宽而强的吸收峰，证明有大量的酚羟基或糖上的羟基存在；同时，在2 928、2 868、1 374 cm-1附近有较强的表征CH2-和CH3-的吸收峰出现，说明饱和碳上的氢较多；而在1 741 cm-1附近由酯羰基（C-O）引起的伸缩振动峰虽然较弱，但在1 648 cm-1附近仍然有羰基的伸缩振动峰出现；此外，在1 648、1 519 cm-1～1 320 cm-1范围内有若干表征苯环的吸收峰存在；且在1 318 cm-1～1 159 cm-1有由羟基的弯曲振动引起的吸收峰出现；而在1 249 和1 062 cm-1附近也出现了C-O-C的反对称和对称伸缩振动峰；最后，在900 cm-1～700 cm-1附近还出现了苯环上取代基位置引起的吸收峰。以上特征峰的出现，均说明了所提取物为典型的黄酮类化合物。
1）采用超声波辅助酶法提取橘皮黄酮，超声波的使用有利于提高黄酮的提取量和加快提取速度，而酶法因使用较低的提取温度而使得黄酮具有较好的生物活性。超声波的功率、缓冲液的pH以及提取温度、时间和酶液用量等因素均对黄酮的提取量有较大影响。
2）经300 W超声波有处理后，在缓冲液pH为4的情况下，经过响应面优化后的提取工艺条件为：52℃酶解温度、90 min酶解时间、0.96 %酶液用量，橘皮黄酮的提取量可达5.82 %。
3）红外光谱分析显示，采用本方法所得到的提取物为典型的黄酮类化合物。
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Response Surface Optimization on Extraction of Orange Peel Flavone Using Ultrasonic-assisted Enzymatic Method
Abstract：Flavone was extracted from orange peel by ultrasonic-assisted enzymatic method，and the effects of enzyme extraction temperature，enzyme dosages，extraction time and pH of buffer solution on the flavone extraction yield were discussed. The process was optimized，and a quadratic regression model was established with response surface methodology（RSM）. The infrared spectroscopic analysis showed that the extraction had representative characteristic of flavonoid. The optimization results of RSM indicated that the extraction yield of flavone was 5.82 % as 52℃enzyme extraction temperature，0.96 % enzyme dosages，90 min enzyme extraction time and 4 pH of buffer solution of orange peel as it pretreated 20 min with 300 W ultrasonic.
Key words：orange peel flavone；ultrasonic-assisted；enzymatic method extraction；response surface optimize
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.014
收稿日期：2015-01-20