图1 多酚标准工作曲线
Fig.1 Standard curve of polyphenols
摘 要：采用超声波辅助提取法及响应面分析法研究了马尾松松塔中多酚的提取工艺。经响应面分析法优化得到的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度65 %、超声时间30 min、超声功率40 W、pH7，多酚提取率为12.68 mg/g。试验结果表明，马尾松松塔含有较为丰富的多酚，具有研究开发的价值。
关键词：马尾松松塔；多酚；提取
多酚是植物和微生物中产生的酚类次生代谢产物，具有潜在促进健康作用的化合物。多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称，包括苯酚酸和黄酮类化合物。多酚类化合物都有一定的抗氧化能力，不少制品已列入天然抗氧化剂的范畴，是优良的氢或电子的给予体，对超氧阴离子和羟自由基等有明显的清除作用。所以多酚类化合物具有降低胆固醇、保护心血管、降血压、降血糖等生物活性[1-3]。
马尾松遍布于华中华南各地，是中国南部主要材用树种，也是荒山造林的先锋树种，经济价值高。马尾松的松油脂、松香、叶、根、茎均可入药，但对于松塔能否入药鲜见有相关的研究。有关研究表明松属植物中含有萜类、多酚类、生物碱等多种生物活性成分[4]，具有抗氧化、抗病毒及抗菌等生物活性[5-6]。为了进一步开发利用马尾松，本研究采用超声波辅助法提取马尾松松塔中的多酚类化合物，以响应面分析法优化其提取工艺，为马尾松的开发及应用提供科学参考。
1.1 仪器与材料
PE Lambda35 UV/VIS紫外可见分光光度计：上海应用实验室；AB135 -S型电子天平：METTLER TOLEDO；DSA50-GL2超声清洗机：德森精工有限公司；202A-2电热干燥箱：上海阳光实验仪器有限公司；PH-3C数显pH计：上海雷磁仪器厂。
松塔：采于江西省赣州市马尾松；没食子酸对照品AB108G（≥98 %）：天津一方科技有限公司；无水乙醇、钨酸钠、磷钼酸、磷酸、碳酸钠等试剂均为国产分析纯试剂；试验用水为蒸馏水。
1.2 方法
1.2.1 标准溶液制备及标准曲线绘制
精密称取没食子酸对照品10.93 mg，配成浓度为109.3 mg/L的没食子酸标准溶液备用。精密量取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL比色管中，加入2 mL Folin-Denis试剂（磷钼钨酸溶液）和4 mL20 %碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至10 mL，摇匀，室温避光放置30 min，以不加标准溶液的相应溶液作空白，在波长760 nm处测定吸光度。
1.2.2多酚提取工艺
松塔经干燥，粉碎，过60目筛，取适量于试管中，加入乙醇溶液，置于超声仪中在一定的超声功率、温度及pH条件下超声提取一段时间后过滤，得供试品溶液。精密量取供试品溶液1.0 mL置于10 mL比色管中，按1.2.1项下的方法，自加入2 mL Folin-Denis试剂起依法测定吸光度。
2.1 多酚标准工作曲线
以多酚浓度C与吸光度A经回归处理，得到标准工作曲线方程为：A=0.111C+0.005 1，R2=0.999 1。表明本方法有较好的线性关系，标准工作曲线见图1。
图1 多酚标准工作曲线
Fig.1 Standard curve of polyphenols
多酚提取率E（mg/g）
式中：C为由A值代入标准曲线方程求得稀释后提取液浓度，mg/L；V为提取液体积，L；D为稀释倍数；M为原料质量，g。
2.2 响应面分析法优化松塔中多酚的提取工艺
2.2.1 RSM分析法考察因素及水平
在单因素的基础上，采用Box-Behnken模型，以对提取率影响较为显著的乙醇浓度、超声时间、超声功率、pH 4个因子为自变量，分别以A、B、C、D表示，松塔多酚提取率为响应值。试验设计见表1。
表1 RSM试验设计与结果
Table 1 Experimental design and results of response surface methodology（RSM）
序号 A乙醇浓度/%功率/W D pH Y提取率/ （mg/g）1 60 30 40 6 11.78 2 60 40 35 6 8.28 3 60 20 40 7 9.11 4 80 20 40 6 8.81 5 40 30 40 5 9.52 6 40 30 35 6 8.89 B超声时间/min C超声
续表1 RSM试验设计与结果
Continue table 1 Experimental design and results of response surface methodology（RSM）
序号 A乙醇浓度/%功率/W D pH Y提取率/ （mg/g）7 80 30 45 6 9.60 8 60 30 40 6 11.69 9 60 30 45 7 10.58 10 60 20 45 6 8.53 11 60 20 35 6 8.02 12 60 30 40 6 11.75 13 80 30 40 7 11.60 14 40 30 40 7 10.09 15 40 40 40 6 7.32 16 60 30 40 6 11.84 17 60 20 40 5 9.88 18 40 30 45 6 8.08 19 60 30 35 7 11.38 20 60 40 40 5 7.30 21 40 20 40 6 7.52 22 80 40 40 6 7.55 23 60 30 45 5 10.21 24 80 30 40 5 9.66 25 80 30 35 6 9.50 26 60 40 45 6 7.07 27 60 30 35 5 9.32 28 60 40 40 7 10.66 29 60 30 40 6 11.83 B超声时间/min C超声
采用Design-Expert 7.0.0软件，根据表1中松塔多酚提取率试验数据进行多元回归拟合，得到多酚提取率对乙醇浓度、超声时间、超声功率和pH的二次多项回归方程：
Y =11.78 +0.44A -0.31B -0.11C +0.63D -0.26AB + 0.23AC +0.34AD -0.43BC +1.03BD -0.42CD -1.47A2-2.49B2-1.31C2-0.079D2
对模型进行方差分析结果见表2。由结果得到：模型P＜0.000 1，说明模型显著，多酚提取率F失拟= 0.065 9，表明失拟项不显著。R2Adj=0.994 0，表明回归方程拟合度较好，可以采用该模型较好地预测和分析松塔中多酚的提取率。由F值可知，对超声法提取松塔多酚提取率影响大小顺序为pH＞乙醇浓度＞超声时间＞超声功率。
2.2.2 因素间的交互作用
乙醇浓度、超声时间、超声功率以及pH对多酚提取率的影响见图2～图7。
表2 拟合二次多项式模型的方差分析
Table 2 Analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model
注：**P＜0.01差异极显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值（显著水平）模型 68.01 14 4.86 329.99 ＜0.000 1** A 2.34 1 2.34 159.00 ＜0.000 1** B 1.13 1 1.13 77.07 ＜0.000 1** C 0.15 1 0.15 9.86 0.007 2** D 4.73 1 4.73 320.96 ＜0.000 1** AB 0.28 1 0.28 19.08 0.000 6** AC 0.21 1 0.21 14.06 0.002 2** AD 0.47 1 0.47 31.87 ＜0.000 1** BC 0.74 1 0.74 50.24 ＜0.000 1** BD 4.26 1 4.26 289.65 ＜0.000 1** CD 0.71 1 0.71 48.50 ＜0.000 1** A2 14.11 1 14.11 958.37 ＜0.000 1** B2 40.09 1 40.09 2 723.21 ＜0.000 1** C2 11.13 1 11.13 755.93 ＜0.000 1** D2 0.040 1 0.040 2.72 0.121 3残差 0.21 14 0.015失拟项 0.19 10 0.019 5.07 0.065 9纯差 0.015 4 0.003 770总差 68.22 28 R2=0.997 0 R2Adj=0.994 0 C.V.%=1.27
图2 乙醇浓度及超声时间对多酚提取率影响的响应曲面
Fig.2 Response surface of ethanol concentration and extraction time on extraction yield of polyphenols
图3 乙醇浓度及超声功率对多酚提取率影响的响应曲面
Fig.3 Response surface of ethanol concentration and power on extraction yield of polyphenols
图4 乙醇浓度及pH对多酚提取率影响的响应曲面
Fig.4 Response surface of ethanol concentration and pH on extraction yield of polyphenols
图5 超声时间及超声功率对多酚提取率影响的响应曲面
Fig.5 Response surface of extraction time and power on extraction yield of polyphenols
图6 超声时间及pH对多酚提取率影响的响应曲面
Fig.6 Response surface of extraction time and pH on extraction yield of polyphenols
图7 超声功率及pH对多酚提取率影响的响应曲面
Fig.7 Response surface of power and pH on extraction yield of polyphenols
由图2～图7可以看出，乙醇浓度、超声时间、超声功率以及pH对多酚提取率的协同作用，响应曲面的最高点即为所选范围内存在的极值。pH的曲线较为陡峭，说明对多酚提取率的影响最显著，其次分别为乙醇浓度、超声时间、超声功率。
2.2.3 验证试验
根据回归模型预测的多酚提取最佳工艺条件为：乙醇浓度64.74 %、超声时间31.50 min、超声功率38.96 W、pH7.00时，多酚提取率预测值为12.53 mg/g。考虑到实际操作的便利，采用修正后的条件进行3次平行试验：乙醇浓度65 %、超声时间30 min、超声功率40 W、pH7。试验测得多酚提取率平均值为12.68 mg/g，与预测值的误差为1.20 %，说明采用响应面分析法优化的最佳提取条件可靠。
本研究采用响应面分析法优化了马尾松松塔多酚提取工艺，得到最佳工艺条件为：乙醇浓度65 %、超声时间30 min、超声功率40 W、pH 7。试验结果表明，马尾松松塔含有较为丰富的多酚，为马尾松的进一步开发利用提供了数据参考。
参考文献：
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Study on Extraction Technique of Polyphenols in Pinecone of Pinus massoniana
Abstract：Based on ultrasonic-assisted extraction，response surface methodology were applied to optimize conditions of polyphenols extraction from pinecone of Pinus massoniana. The optimum conditions as follows：the concentration of ethanol 65 %，extraction time 30 min，power 40 W，pH7. The extraction yield on this condition was 12.68 mg/g. The results showed that pinecone of Pinus massoniana had great development value.
Key words：pinecone of Pinus massoniana；polyphenols；extraction
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.013
收稿日期：2014-01-08