表1 温度对苦素显色性质的影响
Table 1 The influence of the temperature on the chromogenic property of limonin
序号 显色温度/℃ 显色后吸光度A 1 25 0.107 2 30 0.126 3 35 0.116
摘 要：以低温烘干的脐橙皮为原料，利用乙醇-硫酸铵双水相体系提取脐橙皮中的柠檬苦素。利用分光光度计法，研究显色温度等因素对柠檬苦素显色性质的影响，得出最合适的显色温度为30℃。在此基础上，建立柠檬苦素的标准曲线，并通过单因素试验和正交试验考察了乙醇浓度、料液比、硫酸铵用量、提取温度和提取时间对提取率的影响。结果表明：当乙醇体积浓度为60 %，料液比为1∶20（g/mL），硫酸铵用量为12 g，提取温度为50℃，提取时间为4 h时，提取率最高。在此条件下作了5次平行试验，平均得率可达0.345 3 %，而且试验重现性好。
关键词：双水相；脐橙皮；柠檬苦素；正交试验；显色性质
柠檬苦素是一种存在于芸香科类植物果实中的一种三萜类化合物，具有抗肿瘤、镇痛、抗炎、除虫、抗癌等生物活性，广泛应用于食品及药物等领域[1-6]。脐橙就是一种重要的芸香科植物，其果实尤其是果皮中富含柠檬苦素。而果皮作为脐橙产业的副产物，往往被作为垃圾直接抛弃，给环境带来了巨大压力[7-8]。提取脐橙皮中的柠檬苦素既可缓解环境压力，又可充分发挥其经济和现实价值，意义重大。常用提取方法有有机溶剂法[9]、水提法[9-10]等，但存在有毒有害有机溶剂残留问题或者提取率低、提取时间长等诸多问题。双水相提取法[11-12]作为一种新的提取方法，一方面可在较小的有机物浓度下达到较好的提取效果，一方面可同时溶解大量的脂溶性和水溶性成分，使提取体系固液两相易于分离，且用量不使用有毒溶剂，操作简便，条件温和，提取率较高，因此引起人们关注。
常用的双水相体系较多，乙醇-硫酸铵体系不使用有毒溶剂，且分相容易，分离简便，因此本试验选择此体系提取脐橙皮中的柠檬苦素。本试验利用紫外-可见分光光度计，研究了显色温度等因素对柠檬苦素显色性质的影响，并通过单因素试验和正交试验讨论乙醇浓度、料液比、硫酸铵用量、提取温度和时间等因素对提取效果的影响，确定最佳提取条件，比较不同提取方法时的提取效果，为脐橙皮中柠檬苦素的提取提供参考。
1.1 材料与仪器
柠檬苦素标准品：优级纯；对二甲氨基苯甲醛、硫酸铵、乙醇、三氯化铁、硫酸：均为分析纯；脐橙：重庆市奉节县。
BT-224S电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；SHB-B95型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；T-6新世纪型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 测定波长的选择
参照文献[12-13]方法配制显色剂混合溶液和浓度为0.20mg/mL的柠檬苦素标准溶液，准确量取1.00mL标准溶液于10 mL比色管中，加入5.00 mL显色剂混合溶液，摇匀，用无水乙醇定容，显色30 min后，在300 nm～600 nm之间进行扫描，发现在500 nm处出现强吸收峰，因此选择500 nm作为测定波长。
1.2.2 显色温度对苦素显色性质的影响
参照文献[12]方法获取一定量脐橙皮中的柠檬苦素提取液，按照上一步的方法利用显色剂混合溶液，在显色时间为30 min的条件下，选择不同显色温度（25、30、35℃），在500 nm处测定其吸光度。
1.2.3 标准曲线的绘制
参照文献[12]方法，分别精确量取柠檬苦素标准溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL于5支带刻度试管中，用无水乙醇稀释至10 mL，分别加入5.00 mL显色剂，摇匀，在恒定的温度下显色30 min后，在500 nm处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，并求出直线回归方程。
1.2.4 柠檬苦素的提取与测定
柠檬苦素的提取：取低温烘干的脐橙皮粉末2.000 0 g于250 mL圆底烧瓶中，按照设定的固液比加入一定浓度的乙醇溶液和一定量的硫酸铵，在设定的温度下，提取一定时间，抽滤，对滤液进行减压浓缩至干，用无水乙醇溶解并定容到25 mL容量瓶中。
柠檬苦素的测定：准确移取上述提取液1.00 mL于50 mL带刻度比色管中，用无水乙醇稀释至25.00 mL，加入5 mL显色剂混合溶液，在恒定温度下显色30 min后，在500 nm波长处测定吸光度。根据标准曲线回归方程，得到提取液浓度。柠檬苦素得率按照下式计算：
Et/% =（C×V×n）/m×100
式中：Et为得率，%；C为测得的提取液浓度，g/ mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数，m为原料的质量，g。
1.2.5 乙醇浓度对提取效果的影响
在提取温度为40℃，硫酸铵用量8 g，乙醇用量30 mL，提取时间1 h的条件下，选择不同体积浓度（20 %、30 %、40 %、50 %、60 %），重复上述操作。
1.2.6 正交试验
柠檬苦素的得率除受到乙醇浓度的影响外，还受到很多其他因素的影响。参考文献[12]方法，在乙醇体积浓度恒定的情况下，以料液比（m脐橙皮∶V乙醇）、硫酸铵用量、提取温度、时间为考察因素，每个因素选取4个水平，设计了L16（44）正交表来安排试验，每组试验条件做3次平行试验。
2.1 显色温度对苦素显色性质的影响
试验中，显色温度对提取液中苦素显色效果的影响如表1所示。
表1 温度对苦素显色性质的影响
Table 1 The influence of the temperature on the chromogenic property of limonin
序号 显色温度/℃ 显色后吸光度A 1 25 0.107 2 30 0.126 3 35 0.116
从表1可看到，显色后提取液的吸光度随温度的上升而上升，这是因为随着温度的升高，苦素反应活性逐渐增大，但过高的显色温度也会导致苦素分解量增加。因此，30℃是最合适的显色温度。
2.2 标准曲线
柠檬苦素标准曲线如图1所示。
据图1可知该柠檬苦素标准曲线的线性回归方程为A=7.20C-0.002 5，R2=0.996 2。
2.3 乙醇浓度对提取效果的影响
试验中乙醇浓度对体系对柠檬苦素的提取效果影响较大[12]，如图2所示。
图1 柠檬苦素标准曲线
Fig.1 The standard curve of limonin
图2 乙醇体积浓度对柠檬苦素得率的影响
Fig.2 Effect of the ethanol concentration on the extraction of the limonin
从图2可知，随着乙醇浓度的增加，脐橙皮中柠檬苦素得率逐渐增加。这是由于苦素在乙醇中的溶解度大于水中，所使用乙醇浓度的增加导致了双水相体系上层乙醇浓度的增加，因此苦素溶解量也增加。当乙醇体积浓度达到60 %时，柠檬苦素得率达到最大。如果继续增加乙醇浓度，则会破坏双水相体系的稳定性，也会导致大量晶体析出成为沉淀，影响柠檬苦素的浸出。综合考虑这些因素的影响，选择最佳乙醇体积浓度为60 %。
2.4 正交试验
正交试验设计、试验结果及极差分析结果见表2，方差分析见表3。
表2 L16（44）正交试验设计和试验结果
Table 2 L16（44）orthogonal experimental design and results
试验号 A温度/℃B提取时间/h C料液比/ （g/mL）D硫酸铵的用量/g得率/% 1 1（40） 1（2） 1（1∶10） 1（6） 0.161 7 2 1 2（3） 2（1∶15） 2（8） 0.198 6 3 1 3（4） 3（1∶20） 3（10） 0.311 4 4 1 4（5） 4（1∶25） 4（12） 0.315 8 5 2（50） 1 2 3 0.239 8 6 2 2 1 4 0.244 1 7 2 3 4 1 0.263 7
续表2 L16（44）正交试验设计和试验结果
Continue table 2 L16（44）orthogonal experimental design and results
试验号 A温度/℃B提取时间/h C料液比/ （g/mL）D硫酸铵的用量/g得率/% 8 2 4 3 2 0.261 5 9 3（60） 1 3 4 0.268 0 10 3 2 4 3 0.265 8 11 3 3 1 2 0.187 7 12 3 4 2 1 0.172 5 13 4（70） 1 4 2 0.242 0 14 4 2 3 1 0.255 0 15 4 3 2 4 0.237 6 16 4 4 1 3 0.202 9 k1 0.246 9 0.227 9 0.199 1 0.213 2 k2 0.252 3 0.240 9 0.212 1 0.222 5 k3 0.223 5 0.250 1 0.274 0 0.255 0 k4 0.234 4 0.238 2 0.271 8 0.266 4 R 0.028 8 0.022 2 0.074 9 0.053 2最优水平 A2 B3 C3 D4
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment results
注：F0.05（3，3）= 9.280，F0.01（3，3）=29.500，*代表P＜0.05为影响显著。
因素 SS df F F0.05（3，3） 显著性A 0.002 3 2.000 9.280 B 0.001 3 1.000 9.280 C 0.018 3 18.000 9.280 * D 0.008 3 8.000 9.280误差 0.001 3总变异 0.030 15
从表2可看出，脐橙皮中柠檬苦素的得率受到了温度、提取时间、料液比和硫酸铵用量这4个因素的交叉影响，各因素影响的主次次序为料液比＞硫酸铵用量＞提取温度＞提取时间。最佳水平组合为A2B3C3D4，即采用乙醇体积浓度60%，提取温度50℃，提取时间4h，脐橙皮和乙醇的料液比1∶20（g/mL），硫酸铵用量12 g。
为了进一步确定试验因子的可信度，对脐橙皮中柠檬苦素得率的正交试验结果方差分析见表3。从表3可看到，在脐橙皮所选择提取工艺正交实验所选取的因素和水平范围内，因素C即料液比的影响达到了显著的水平，因素A、B、D的影响未达到显著水平，即提取温度、提取时间和硫酸铵用量对脐橙皮中柠檬苦素的提取影响不显著。而F值结果表明，方差分析结果与直观的极差分析结果一致。
对正交试验结果进行5次平行试验验证，结果脐橙皮中柠檬苦素得率分别为0.419 9 %、0.339 6 %、0.281 0 %、0.304 9 %、0.380 9 %，平均值0.345 3 %，这与正交试验结果一致。
2.5 几种提取方法的对比
表4 列举了不同提取方法提取柑橘类果皮渣苦素的情况。
表4 几种提取方法下的柠檬苦素提取情况
Table 4 The extracting effects of the limonin by several kinds of extracting method
单纯双水相非超声波（本文）提取体系固液分离难易 难分离 难分离 易分离取得最佳提取效果时的乙醇浓度/%提取方法 非双水相乙醇提取[5]超声波辅助乙醇提取[6]80 82 60苦素得率/% 0.085 6 0.163 2 0.345 3
从表4可看出，非双水相提取的提取体系存在提取体系固液两相难分离的情况，也使苦素的提取受到干扰，得率较低；而对于使用双水相提取方法提取时，由于双水相体系同时可溶解脐橙皮中的油溶性成分和水溶性成分，减少了提取体系的黏度，因此提取体系的固液两相分离较容易，再加上双水相体系的分相作用带来的体系上层乙醇浓度的增加，保证了使用较低浓度乙醇60 %的情况下取得较好的提取效果，甚至优于超声波辅助乙醇提取时的得率。因此双水相提取法提取脐橙皮中柠檬苦素的提取方法是一种很有发展前途的提取方法。
本文通过分光光度法对显色温度对柠檬苦素显色效果的研究，得出脐橙皮提取液中柠檬苦素的最佳显色温度为30℃。通过设计单因素试验和正交试验，得出了乙醇-硫酸铵双水相体系中影响柠檬苦素得率指标的因素大小顺序为：料液比>硫酸铵用量>提取温度>提取时间；提取脐橙皮中柠檬苦素的最佳工艺条件为：乙醇体积浓度60 %，硫酸铵用量12 g，脐橙皮和乙醇的料液比1∶20（g/mL），提取温度50℃，提取时间4 h。并通过平行试验在最佳工艺条件下提取脐橙皮中柠檬苦素，不但提取率较高，而且试验重现性好，说明正交试验得出的结论是正确的。通过对比也知道双水相提取法是一种易分离，提取效果较好的提取方法。该研究结果对于天然产物中有效成分的提取研究具有一定的参考价值。
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Study on the Extraction of the Limonin in the Navel Orange Peel by Aqueous Two-phase System and the Color
Abstract：With the low-temperature baked navel orange peel as material，the limonin was extracted from the navel orange peel by the aqueous two-phase system of ethanol-（NH4）2SO4. The influence of the temperature on the chromogenic property of limonin was studied by spectrophotometric method，and the optimal chromogenic temperature was 30℃. On the basis，the standard curves on the limonin was established，and the effects of ethanol concentration，solid-liquid ratio，amount of the ammonium sulfate，extraction temperature and extraction time on the extraction rate were studied by the single factor experiments and the orthogonal tests. The results showed that when the volume concentration of alcohol was 60 %，the solid-liquid ratio was 1∶20（g/mL），the amount of the ammonium sulfate was 12 g，the extraction temperature was 50℃and the extraction time was 4 h，the extraction rate reached the maximum. Under the optimum conditions，five parallel experiments were carried out and the average extraction rate reached 0.345 3 %. The reproducibility of the experiments was good.
Key words：aqueous two-phase system；navel orange peel；limonin；orthogonal test；chromogenic property
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.012
基金项目：四川省教育厅青年基金资助项目（09ZB036）；内江师范学院校级科研项目（14ZB01）
收稿日期：2014-11-09