代谢组学法考察金银花醇提物对DMN诱导大鼠肝损伤的保护作用

滕杨1，2，罗时旋1，郭英雪1，谭天1，张宇1，孙长海1，高金波1，李永吉2，*
（1.佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

摘　要：探讨基于代谢组学法考察金银花醇提物对DMN诱导的大鼠急性肝纤维化损伤的保护作用。建立DMN诱导的大鼠急性肝纤维化损伤模型，采用DMF衍生大鼠尿液，用气相-质谱的代谢组学方法，从整体代谢水平上考察尿液中内源性小分子代谢物的变化，使用主成分分析（PCA）法探寻大鼠尿样的代谢物谱的模式变化及潜在的生物标记物。尿液的GC-MS指纹图谱可知DMN所致大鼠尿液中内源性小分子代谢物中有3种物质含量增加和6种物质含量降低，发生了代谢网络扰动象。经金银花醇提物干预后，其尿液代谢表型有向正常范围回归的趋势，呈现代谢网络修复的结果。说明预先灌胃金银花醇提物对DMN染毒大鼠的生理及代谢状况产生了有效的保护作用。

目前保肝药物筛选及药效评价主要通过各种血清酶指标数据，如谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）等，此类方法仅对肝损伤程度进行定性描述，不能很好地反映药物干预的作用机理[1]。代谢组学能从整体角度反映疾病的状态，揭示生命体所有代谢物及其中间体种类、数量及其变化规律，与其它方法结合，可用于疾病的诊断、药物作用机制、药物毒理学及植物学等方面研究[2-4]。因此，本文使用GC-MS法分析大鼠的尿样的代谢物谱，使用多元模式识别方法分析正常组及造模组、给药治疗组大鼠的代谢物谱差异，找出潜在的生物标记物。并通过比较在金银花醇提物干预下这些代谢物的变化情况，探讨了金银花醇提物对于DMN致大鼠肝损伤的保护作用。

1　材料与方法

N-甲基-三甲基硅烷-三氟乙酞胺（BSTFA）、富马酸二甲酯、二甲基亚硝胺（DMN）：日本和光纯药工业株式会社；金银花75 %醇提取物：日本高知医科大学附属医院药剂部实验室自制；雄性Wistar大鼠：日本高知大学实验动物中心。

Model QP5050A气相色谱-质谱联用仪：日本岛津公司；另配有毛细管柱（DB-1 column 60 m×0.32 mm，film thickness 0.1 μm）。

1.3.1　样品收集

30只Wistar雄性大鼠，于室温20℃、12 h光照和12 h避光环境下自由饮食、饮水。驯养7 d后随机分成3组，正常组（n）、模型组（c）和金银花治疗组（t），金银花组注射DMN前用（tn）表示。除正常组外，在第14 d按体重35 mg/kg剂量腹腔注射DMN[5-6]，在制备模型的同时金银花治疗组从第7 d开始每天上午9：00 以2 g/kg剂量灌胃给药，连续7 d，正常组和模型组均予等量生理盐水灌胃。利用代谢笼分别收集驯养7 d后的第1、3、5、7 d（pro-dose）的24 h大鼠尿样和DMN造模后的1、3、5、7 d（after-dose）的24 h大鼠尿样，标号后立刻放入-80℃冰箱保存，待用。

1.3.2　样品预处理

尿样冰盒内解冻后离心3 000 r/min，15 min，然后取上清尿液300 μL加入乙腈300 μL，混匀，离心10 000 r/min，60 min。再取上清液150 μL，真空干燥。加入衍生化试剂富马酸二甲酯（DMF）100 μL，N-甲基-三甲基硅烷-三氟乙酞胺（BSTFA）50 μL，常温超声5 min，再水浴80℃加热30 min，室温冷却10 min，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，供GC-MS分析使用。

1.3.3　GC-MS分析条件

进样量1 μL；分流比1∶25；载气为高纯氦气；流速1.0 mL/min；采样时间2 min；离子源温度300℃；检测器温度280℃；入口压力91 kPa；线速度35 cm/s；全流量50 mL/min；电力电压70 eV；扫描方式为全扫描40 Hz～500 Hz。升温程序：80℃保持2 min经1℃/min升温到90℃，持续10 min，经2℃/min升温108℃，持续10 min，经2℃/min升温至110℃，持续10 min，经2.5℃/min升温至285℃，保持10 min[7]。

1.3.4　数据处理

使用岛津色谱工作站对GC-MS（40 m/z～500 m/z）总离子流图中各种代谢物峰面积进行积分，使用Matlab（version 7.0.1，Mathwork Inc.）软件，去掉GCMS分析中过载的代谢物峰后，经Help分析方法预处理减少噪声和化学位移漂移的影响。将试验的所有样本用自编Matlab语言程序进行色谱峰识别及峰匹配，并采用主成分分析法（PCA）对各组大鼠尿液的代谢物GC-MS指纹图谱进行分析。

2　结果与讨论

2.1　DMN对大鼠尿液代谢物色谱图的影响

正常组和模型组注射DMN前尿样总离子流图见图1、图2。

由图1、图2可知，正常组、模型组大鼠所得尿液经上述1.3.2项方法处理制备后，按照每个样品进样1 μL，连续进样采集数据，获得大鼠尿液中低分子量代谢组TIC轮廓图并对正常组和模型组大鼠DMN注射前1天和注射后第1、3、5、7 d的尿液样品进行分析（截取60 min～125 min的总离子流图，因为前60 min尿样的色谱图没有明显变化），获得代谢组轮廓图。从图中可以观察到模型组大鼠尿液代谢组轮廓在注射DMN前7d与正常组比均无明显改变。

模型组注射DMN后1、3、5 d和7 d尿样总离子流分别见图3～图6。

由图3～图6可知，从给予DMN干预1 d后，模型组大鼠尿样代谢组轮廓开始发生变化，至第7 d时，可以发现代谢轮廓明显偏离注射DMN前1 d的代谢轮廓，揭示在外源物DMN干预下引起了大鼠机体代谢网络的扰动。

2.2　金银花醇提物对大鼠尿样的代谢组学研究

金银花治疗组大鼠经金银花灌胃7 d后注射DMN，再继续给药7 d进行治疗。大鼠所得尿液经上述

1.3.2　处理方法制备后，按照每个样品进样1 μL，连续进样采集数据，获得大鼠尿液中低分子量代谢组TIC轮廓图，并对注射DMN后第1、3、5、7 d的尿液样品进行分析（截取60 min～125 min的总离子流图，因为前60 min尿样的色谱图没有明显变化），获得代谢组轮廓图。治疗组注射DMN前1 d、后1 d、后3 d、后5 d、后7 d尿样总离子流分别见图7～图11。

由图7～图11可知，从图中可以观察到治疗组大鼠尿液代谢组轮廓在注射DMN前1 d与正常组比较无明显改变。从给予DMN注射1 d后，代谢组轮廓开始发生变化，至第5 d时，可以发现治疗组大鼠尿样代谢轮廓偏离注射DMN前1 d的代谢轮廓达到最大值，但到第7 d时发现代谢轮廓有明显的回归趋势，且已经接近正常组的代谢轮廓。揭示金银花醇提取对DMN干预引起的机体代谢网络的扰动有恢复作用。

2.3　DMN诱导大鼠肝损伤模型生物标记物的确定

正常组（n）、金银花治疗组注射DMN前（tn）、模型组第1、3、5、7 d（c1、c3、c5和c7）和金银花治疗组第1、3、5、7 d（t1，t3，t5和t7）的尿液的代谢GC/ MS的TIC图进行比较分析，发现了19个信噪比大于10的色谱峰，并用其构建一个19维向量，用来描述尿样代谢的生化学模式。每一个向量用Matlab软件的ZScore函数进行标准化处理，以便校正样品浓度产生的差异。采用主成分分析的方法结合自编的Matlab语言程序对此19维向量进行降维处理，得到一个二维向量（第一主成分PC1对第二主成分PC2），结果见图12和图13。

根据主成分及标示内源性代谢物离子对离散趋势贡献程度的分析，得到了对分类贡献最大的9种化合物，见表1所示。大鼠尿样中这9种内源性小分子代谢物可被视为是DMN对大鼠机体生理内源性代谢产生扰动的潜在生物标记物。其中3种物质（8-phenyl-8-azbicyclo [4.3.0] non-3-ene-7，9-dione、Bis（omethyloxime）-4 - Ketoglucose）和2 -（6 -heptynyl）-1，3 -dioxolane含量增加；6种物质　2 -（4 -Chlorophenylthiomethoxy）ethyl、Tetrahydro-2-Furanacetaldehyde、Galacturonic acid、ErythroPentonic acid、Malonic ac-id和d-Galactose含量降低。经金银花醇提物干预后，DMN造模所致3种物质含量增加和6种物质含量降低的代谢紊乱均得到了明显的改善，其尿液代谢表型有向正常范围回归的趋势，呈现代谢网络修复的结果。

2.4实验大鼠尿液代谢物的图谱分析

采用主成分分析的方法，对模型组大鼠不同天数的尿液的代谢指纹数据进行分析，绘制出了反映组间离散程度的图12和13。可知腹腔注射DMN后大鼠尿液代谢物组发生了明显的变化，与注射DMN前相比明显被分类，且这种变化随着DMN注射后天数的增加而逐渐变大。说明DMN注射后大鼠正常生理代谢被干扰，从机体生理内源性代谢物变化的层面上可认为DMN肝纤维化损伤模型制作成功。

由图13的结果表明，不同时间的模型组、治疗组与对照组的偏离程度不同，呈现一定的时效关系。模型组大鼠尿样的代谢物谱的模式随时间的推移偏离正常组越来越远，表明肝损伤程度也是愈加严重。治疗组大鼠尿样的代谢物谱的模式在第5 d偏离正常组最远，然后开始呈现恢复趋势，到第7 d已经接近正常组。此变化清楚地显示从大鼠中毒损伤到恢复整个变化的动态过程，揭示了代谢组学法可用于研究动物的对复杂条件发生应激反应时的生理变化特征，尤其可作为一种非损伤性的动态监测方法来评价天然药物的药效学评价方法。

3　　结论

综上所述，本研究建立了GC-MS代谢组学分析方法，并将其应用于DMN致大鼠急性肝损伤的研究，利用PCA法将大鼠尿样的GC-MS总电子流图谱的不可视的19维向量降维到二维的可视化数据，判别尿样中代谢物谱的模式变化规律，能准确表明肝损伤程度与染毒时间的关系，并利用质谱数据库快速鉴定代谢物，结果发现部分游离丙二酸、D-半乳糖酸、马尿酸等物质氨基酸和苹果酸等几种代谢物的含量变化与肝损伤程度密切相关。代谢物谱的模式变化规律和代谢物含量变化规律，都与之前已发表的动物实验血清生化指标和肝组织病理检查结果一致。因此，GC-MS联用技术简便可靠，在代谢物分离与鉴定方面具有一定的优势，适用于代谢组学研究。

[1] N J Waters. Integrated metabonomic analysis of bromobenzene-induced hepatotoxicity: novel induction of 5-oxoprolinosis[J]. Proteome Res, 2006 (5):1448-1459

[2] M Coen, E M Lenz, J K Nichloson,et al. An interated metatonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy[J]. Cem. Res. Toxicol,2003 (16): 295-303

[3] M E Bollard. Comparative me-tabonomics of differential hydrazine toxicity in the rat and mouse[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2005(204): 135-151

[4] N J Waters. Metabonomic deconvolution of embedded toxicity: application to thioacetamide hepato-and nephrotoxicity[J]. Chem Res Toxicol, 2005(18):639-654

[5] Wang X B, Liu P, Tang Z P.Cordyceps mycelia extract decrease portal hypertension in rats with dimethylnitrosamine induced liver cirrhosis[J]. Chin Integr Med, 2008 (11) :1136-1145

[6] Shin J W, Son J Y.An herbal formula exert on hepatotherapeutic effects by dimethynitrosamine-induced chronic injury model in rats [J]. World Gastroenterol,2006, 12(38):6142-6148

[7] Y P Lin, D Y Si, Z P Zhang, et al. An integrated metabonomic method for profiling of metabolic changes in carbon tetrachloride induced rat urine[J]. Toxicology,2009(256) :191-200

Protective Effects of Lonicera Japonica Extract on Acute Liver Injury in Rats by the Method of Metabolomic

TENG Yang1，2，LUO Shi-Xuan1，GUO Ying-xue1，TAN Tian1，ZHANG Yu1，SUN Chang-hai1，GAO Jin-Bo1，LI Yong-ji2，*
（1. Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China；2. Heilongjiang University Of Chinese Medicine，Haerbin 150040，Heilongjiang，China）

Abstract：Discussed the effect of protection on the liver fibrosis induced by DMN in rats base on the method of metabolomic. The rats model was established by DMN with acute injury of liver fibrosis and all the urine were derived with DMF. Then investigated the endogenous small molecule metabolites in urine from the whole lever of metabolism changes. Researched the spectral pattern change of metabolites and potential biomarkers in rat urine with principal component analysis（PCA）method. It found that the peak areas of 6 metabolites significantly decreased and 3 metabolites significantly increased after DMN injection and the variations were inhibited after LJE intervention. The metabolic disorders have been significant adjustments and the urinary metabolic phenotype return to normal trend. Based on these results，LJE have protection on liver.

Key words：metabolomic；Lonicera japonica extract with ethanol；acute liver fibrosis

作者简介：滕杨（1982—），女（汉），讲师，在读博士，主要从事中药药剂学、天然药物活性及功能研究。

*通信作者：李永吉（1957—），男，教授，博士研究生导师，主要从事中药注射剂及中药经皮给药。

代谢组学法考察金银花醇提物对DMN诱导大鼠肝损伤的保护作用

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

1　材料与方法

2　结果与讨论

3　　结论