摘 要：主要研究鱼头多糖对K562细胞的抑制作用。通过MTT法检测鱼头多糖对K562细胞的增殖抑制率，HE染色法观察K562细胞形态学的变化，流式细胞仪检测K562细胞的凋亡情况。结果表明，MTT法测定在药物浓度≤200μg/mL时，鱼头多糖对K562细胞增殖有明显抑制作用，其抑制率与时间、浓度呈正相关。HE染色显示多糖作用于K562细胞后出现了明显的凋亡和坏死同时发生的现象，且表现出时间依赖性。流式细胞仪检测多糖对K562细胞周期分布有显著影响，且凋亡现象明显，并伴有明显的坏死现象。在多糖作用72 h后，凋亡细胞的比例高达细胞21.28 %。因此，提示鱼头多糖对K562细胞的增殖抑制作用明显。
关键词：鱼头多糖；K562细胞；增殖抑制
白血病是一类造血干细胞的克隆性恶性疾病，近年来其发病率呈现上升趋势。其发病机理与肿瘤细胞异常分化、细胞增殖过度、细胞凋亡减少有关。研究表明，凋亡是肿瘤发生发展中的一个重要因素，在恶性肿瘤中，细胞的凋亡率明显降低。若能诱导肿瘤细胞凋亡，增加其凋亡比例，则可抑制肿瘤的增殖[1-2]。鱼头中含有丰富的多糖、蛋白质等多种可预防疾病的功能物质，比如各种鲨鱼、安康鱼的鱼头软骨中含有的多糖类物质，实验证实具有抗动脉硬化、冠心病、偏头痛、抗肿瘤等作用[3-4]。本文拟采用生物酶辅助微波法提取鱼头多糖，探讨纯化后的鱼头多糖对人白血病K562细胞的诱导凋亡作用，为鱼头多糖在人白血病防治领域提供理论参考。
1.1 材料、试剂与仪器
人红白血病细胞K562：天津医科大学免疫学教研室；RPMI-1640、胎牛血清（FBS）：购于中国血液研究所；牛血清白蛋白（BSA）：北京红兴化学试剂分装厂（进口分装）；TC 2323D水套式CO2培养箱：美国Shellab；Nikon TS-100倒置显微镜：日本尼康公司；酶标仪：Thermo Electron U.S.A；流式细胞光度仪：BD Bioscience U.S.A。
1.2 方法
1.2.1 鱼头多糖的提取工艺
鱼头多糖的提取工艺：鱼头用胶体磨磨碎后以1 %甲醇浸泡24 h进行脱脂。而后浸于弱碱性氢氧化钠（1 mol/L）溶液，搅拌至充分溶解，离心（3 000 r/min，3 min）弃去滤渣，取上清溶液，过滤得滤液，并以冰醋酸滴定至pH=5，产生沉淀。离心（3 000 r/min，3 min）除沉淀，得到上清液。将上清液进行旋转蒸发浓缩（50℃，6 h）得浓缩液，浓缩液用sevage法[5-6]除蛋白后以乙醇沉淀（75 %，4 h），离心（3 000 r/min，3 min）得产物，进一步用95 %的乙醇洗涤除盐，过DEAE Sephadex A-25柱洗脱后冷冻干燥得产物A。
1.2.2 细胞培养
K562细胞培养于10 %新生牛血清、100 U/mL青链霉素的1640培养液中，并置于37℃、5 % CO2的恒温培养箱内培养。每48 h更换一次培养液，按照1∶3的比例传代培养。
1.2.3 MTT法检测细胞增殖抑制[7-9]
将1×105个/mL细胞悬液接种于96孔板中，每孔加200 μL。试验组同时分别加入不同浓度的多糖，至终浓度为50、100、200、400、500 μg/mL，每个浓度6个平行孔，另设6个不加多糖的细胞孔作为阴性对照。37℃、5 %CO2培养箱培养24、48、72 h后1 000 r/min离心10 min，弃去上清。再向每孔加入0.5 mg/mL的MTT与pH7.4的PBS缓冲液的混合液100 μL，继续培养4 h后，1 500 r/min离心15 min，弃去上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），震荡2 min使细胞中的结晶物充分溶解，用酶标仪测定570 nm波长下的吸光度值，并计算各浓度的软骨多糖对细胞生长的抑制率（M）。计算公式如下：
M =（A无药组- A用药组）/A无药组×100 %
式中：A无药组为不加入任何多糖药物的K562细胞组（即空白组）的吸光度值；A用药组为加入不同浓度多糖药物的K562细胞组（即给药组）。
1.2.4 HE染色观察细胞形态
将K562细胞与200 μg/mL的鱼头多糖A进行共同培养，分别培养24、48、72 h后将细胞以PBS（pH 7.3）清洗并固定。固定后的细胞先以苏木精染液浸染10 min，去离子水洗后置于伊红染液中浸染3 min，然后以梯度酒精进行浸洗，最后以显微镜观察各组细胞形态学变化[9-10]。
1.2.5 流式细胞仪（FCM）测定细胞周期分布[11-12]
离心收集至少1×106个细胞，用0.01 mol/L pH7.2的冷PBS洗2次后，均匀分散在70 %的冷乙醇中，4℃固定18 h以上。上机测定前，离心去乙醇，用PBS洗3次，加100 mg/L的RNAnaseA 37℃消化30 min后，用50 mg/L的PI 4℃避光染色30 min以上，经尼龙网过滤后，用流式细胞仪测定细胞的DNA含量，结果用Modifit软件处理，计算出各周期时相的细胞百分比。DNA含量小于单倍体的细胞（亚G0/G1期即Sub-G0/G1的细胞）代表凋亡细胞。
1.3 统计学处理
应用统计软件SPSS 19.0对数据进行直线回归和方差分析，结果采用x±s表示。以P＜0.05为显著性差异，以P＜0.01为极显著性差异。
2.1 鱼头多糖对肿瘤细胞的增殖抑制作用
通过MTT实验研究鱼头多糖对肿瘤细胞的增殖抑制作用，试验结果如表1所示。
表1 鱼头多糖对K562细胞增殖的抑制作用（n=4，x±s）
Table 1 Growth inhibition of fish head polysaccharides on K562 cells
注：*表示与100 μg/mL时相比，P＜0.01。
鱼头多糖浓度/ （μg/mL）抑制率/% 24 h 48 h 72 h 50 44±3.25 50±2.13 55±2.42 100 48±1.76 53±2.04 59±2.52 200 83±3.01** 84±2.20** 86±1.33** 300 83±2.73 84±2.46 86±2.68 400 84±3.59 85±2.92 86±4.21 500 85±3.51 85±2.72 88±1.21
不论何种药物浓度情况下，随着作用时间的增加，对K562细胞的抑制率都有所增加，但是增加的效果不是很明显，即没有显现时间依赖性。对于同样的作用时间，作用浓度为50 μg/mL和100 μg/mL时，抑制率为44 %～59 %；而当浓度提高到200 μg/mL时抑制率达到83 %～86 %，出现了显著的抑制作用（P＜0.01）。当药物浓度继续加大到300、400、500 μg/mL时，抑制率无明显增加，基本处于和200 μg/mL相同的状态。药物浓度为50 μg/mL和100 μg/mL时，抑制率明显低于其他药物浓度，对研究的意义不是很大。
因此，在药物浓度≤200 μg/mL时，鱼头多糖对K562细胞增殖有明显抑制作用，对K562细胞的生长抑制率与时间、浓度呈正相关。从减少试验时间，提高试验效率等角度综合考虑，采用鱼头多糖浓度为200 μg/mL进行后续试验研究。
2.2 HE染色观察细胞形态变化
通过HE染色观察空白组和给药组的细胞形态变化情况，试验结果如图1所示。
图1 K562细胞HE染色结果
Fig.1 Results of K562 cells stained with HE
图1 所示，未加药的正常K562细胞着色较深，整个细胞均为蓝紫色，表明无多糖作用的细胞细胞膜结构完整，染料分子不容易进出；而加药后的细胞颜色明显变浅，说明由于多糖的作用改变了细胞膜的通透性，使染料分子容易透出细胞膜，因而颜色较浅；同时，药物处理后，K562细胞受到了一定的损伤及发生了凋亡现象，如细胞内容物流出、出现了细胞碎片、细胞核固缩及细胞膜形态不规则等细胞凋亡特有的形态学特征。随着加药时间的增加，细胞凋亡的形态学特征越来越明显，说明多糖能够诱导K562细胞发生凋亡。
2.3 流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡
通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况，检测结果如表2、图2所示。
表2 鱼头多糖对K562细胞周期分布的影响
Table 2 Effect of cell cycle distribution of fish head polysaccharides on K562 cells
各周期细胞所占百分比作用时间/h Sub-G0/G1 G0/G1 S G2/M 0 6.21 21.85 59.27 12.66 24 48 72 9.68 12.32 21.28 18.49 14.46 5.89 62.38 66.84 70.38 9.43 6.37 2.44
图2 鱼头多糖对K562细胞周期分布图
Fig.2 The cell cycle distribution map of fish head polysaccharide on K562 cells
多糖处理后的细胞，随着作用时间的增加，细胞周期分布发生了改变。Sub-G0/G1期细胞数量逐渐增多，说明凋亡细胞增多。此外，S期细胞比例增加，G0/G1和G2/M比例减少，说明多糖诱导K562细胞阻滞在S期，即大部分细胞被阻断在DNA复制时期。与HE染色结果结合来看表明：多糖对K562细胞周期分布有显著影响，且通过将细胞周期阻滞在S期而达到诱导K562细胞凋亡的作用。
弱碱法提取的鱼头多糖作用于K562细胞后，MTT法测定在药物浓度≤200 μg/mL时，鱼头多糖对K562细胞增殖有明显抑制作用，并选取200 μg/mL作为后续试验的作用浓度。HE染色显示多糖作用于K562细胞后出现了明显的凋亡和坏死同时发生的现象，且表现出时间依赖性。流式细胞仪检测多糖对K562细胞周期分布有显著影响，且凋亡现象明显。在多糖作用72 h后，凋亡细胞的比例高达细胞21.28 %，并且将细胞周期阻滞在S期。因此，试验结果表明：鱼头多糖对K562细胞有明显的增殖抑制作用，并可能通过将细胞周期阻滞在S期而实现诱导细胞凋亡的作用。
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Study on Proliferation Inhibition of the Fish Head Polysaccharides on K562 Cells
Abstract：The aim of this paper was to study the effect of human leukemia K562 cells treated by the fish head polysaccharides. MTT method was used to test the proliferation inhibition rate of K562 cells，and HE staining was used to observe the morphological changes of K562 cells，and flow cytometry was used to test the apoptosis of the K562 cells. The result indicated the proliferation of K562 cells was obviously inhibited，and the inhibitory rate was positive correlation with time and concentration when the drug concentration was less than 200 μg/mL. HE staining displayed the K562 cells presented obvious apoptosis and necrosis phenomenon with time dependence. The flow cytometry testing indicated the polysaccharides had a significant impact on the K562 cell cycle distribution，as well as obvious apoptosis and necrosis phenomenon. The rate of apoptosis cells run up to 21.28 %. Therefore，it showed the fish head polysaccharides had obvious impact on the proliferation inhibition of the K562 cells.
Key words：fish head polysaccharides；K562 cells；proliferation inhibition
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.04.005
基金项目：河北省高等学校科学技术研究项目（Z2014003）
收稿日期：2014-11-17