图1混合对照品的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances
摘 要：建立HPLC-RI法同时测定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的含量。采用Inertsil NH2色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），乙腈∶水（80∶20，体积比）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30℃。果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的线性范围分别是3.9116μg～156.4655μg（r=0.9996）、3.1887μg～127.5491μg（r=0.9996）、2.6983μg～107.9337μg（r=0.9991）、4.290 9 μg～171.635 4 μg（r=0.999 8）、3.730 9 μg～149.237 7 μg（r=0.999 6）；平均加样回收率分别为98.6%、98.4%、97.8%、97.8%、99.2%，RSD分别为1.28%、1.70%、1.63%、1.55%、1.81%。
关键词：HPLC-RI；总糖；果糖；葡萄糖；蔗糖；麦芽糖；乳糖
糖类化合物是自然界中为人体提供能量的最主要营养素，也是大部分食品的主要成分之一。实际工作中发现绝大多数食品中主要含果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖这5种糖。国家标准GB/T 5009.7-2008《食品中还原糖的测定》、GB/T 5009.8-2008《食品中蔗糖的测定》和GB/T 20977-2007《糕点通则》中规定了食品中还原糖、蔗糖和总糖的检测方法［1-3］，均采用的化学滴定的方法，该方法样品预处理过程长，分析时间长，检测效率低。而食品中糖的含量是一样重要指标，化学滴定法的检测结果受水解温度、水解时间、滴定温度和滴定速度等多因素的影响［4］，并且化学滴定法无法满足快速检测大批量样品的要求，影响检测时效性，因此在参考GB/T 18932.22-2003《蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测法》和GB/T 20882-2007《果葡糖浆》的基础上采用HPLC-RI同时测定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖这5种糖的含量［5-6］。新建立的检测方法快速、简单、准确。
DIONEX P680 ASI-100高效液相色谱（包括P680泵、Shodex RI-101示差折光检测器、ASI-100自动进样器、Chromeleon液相色谱工作站）：戴安公司；METTLER AB265-S电子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司。
标准品葡萄糖（批号110833-201205）、果糖（批号100231-201305）、蔗糖（批号111507-201303）、麦芽糖（批号100287-201303）、乳糖（批号100058-201204）：均购自中国食品药品检定研究院；乙腈：色谱纯；水：超纯水；其余试剂均为分析纯。
样品共计12批，均来自荆州市食品药品检验所日常检验之样品。
2.1 混合对照品溶液的制备
精密称取上述对照品适量至10mL容量瓶中加6mL水溶解后用乙腈定容至刻度，摇匀，得混合标准品溶液（果糖10.431 0 mg/mL、葡萄糖8.503 3 mg/mL、蔗糖7.195 6 mg/mL、麦芽糖11.442 4 mg/mL、乳糖9.949 2 mg/ mL），然后分别将标准品溶液稀释2、5、10、20、40倍得到不同浓度的标准品溶液，用于绘制标准曲线。
2.2 供试品溶液的制备
先将样品粉碎后取样约5.0 g，精密称定，加适量水超声溶解后置100 mL容量瓶中加乙腈定容至刻度，过滤，滤液过0.45 μm滤膜。
2.3 色谱条件
色谱柱：InertsilNH2色谱柱（5μm，4.6mm×250mm）；流动相∶乙腈-水（80∶20，体积比）；流速：1.0 mL/min；检测器：Shodex RI-101示差折光检测器（检测池温度：45℃）；柱温：30℃；进样量15 μL。
2.4 线性关系考察
吸取上述不同浓度的标准品溶液，按照“2.3”项下的色谱条件进样测定。以浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
2.5 精密度试验
取“2.1”项下的混合标准品溶液，以“2.3”项下色谱条件连续进样测定5次。
2.6 稳定性试验
取同一批样品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.3”项下色谱条件，分别于制备后0、2、4、6、12、24 h进样检测各成分的峰面积。
2.7 重复性试验
取同一批样品6份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.3”项下色谱条件进样测定。
2.8 加样回收试验
取“2.6”项已测知含量的同一批样品5份，每份精密加入已知浓度的混合标准品溶液5 mL，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.3”项下色谱条件进样检测，计算回收率。
2.9 样品含量测定
取本所日常检验的样品12批分别用化学滴定法和HPLC法测定样品中总糖含量，最终结果都以葡萄糖计。
3.1 混合对照品溶液色谱图测定
取“2.1”项下混合对照品溶液，按“2.3”项下色谱条件试验，色谱图见图1。
图1混合对照品的HPLC色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances
3.2 线性关系考察
线性关系考察结果见表1。
表1 各被测成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围
Table 1 Regressive equations,correlation coefficients,and linear ranges of the investigated components
成分 回归方程 r 线性范围/μg果糖 Y=0.384 6X+0.042 7 0.999 6 3.911 6～156.465 5葡萄糖 Y=0.374 1X+0.049 3 0.999 6 3.188 7～127.549 1蔗糖 Y=0.395 4X-0.017 8 0.999 1 2.698 3～107.933 7麦芽糖 Y=0.391 7X+0.015 7 0.999 8 4.290 9～171.635 4乳糖 Y=0.389 6X+0.089 7 0.999 6 3.730 9～149.237 7
3.3 精密度试验
精密度试验结果，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖含量RSD值依次为0.47%、0.66%、0.63%、0.45%、0.10%。
3.4 稳定性试验
稳定性试验结果，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖峰面积24 h内的RSD（n=6）分别为0.58%、1.27%、0.94%、0.70%、0.73%，表明样品中各成分在24 h内稳定。
3.5 重复性试验
重复性试验结果，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖含量RSD值依次为1.09%、1.24%、1.03%、0.93%、1.19%。
3.6 加样回收试验
加样回收试验结果见表2。
3.7 样品含量测定
样品含量测定，经配对t检验，P≥0.05，两种方法检测结果无显著性差别，结果见表3。
表2 各成分的加样回收率结果
Table 2 The recovery of standard addition of the components
成分 回收率/% 均值/%RSD/%样品1样品2样品3样品4样品5果糖 100.27 97.77 99.08 96.97 98.71 98.6 1.28葡萄糖 99.51 100.78 97.31 97.54 96.87 98.4 1.70蔗糖 97.56 98.46 99.33 98.32 95.15 97.8 1.63麦芽糖 96.19 99.66 98.76 96.32 97.93 97.8 1.55乳糖 99.14 99.79 101.95 97.60 97.64 99.2 1.81
表3 12批样品两种不同检测方法结果对比（X±S，n=12，%）
Table 3 The detect resulst obtained by two methods（X±S，n= 12，%）
tP HPLC 12 28.328 3±10.083 1化学滴定 12 28.420 8±10.066 2差值 12 0.092 5±0.198 7 1.612 0.135组别 样品例数（n） X±S
在大量的实际检验工作中发现绝大多数食品中都是含果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖中的一种或多种糖，所以选择这5种糖作为检测指标。综合考虑实际检测结果的分离度、仪器的性噪比以及实际工作所测得的样品的糖含量而最终确定该方法的色谱条件和线性范围。特别指出的是在检测含糖量高的样品时应减少取样量或增加样品溶解时的水的量以使样品中得糖能充分溶出。若样品全部用水溶解则会影响各成分峰形和分离度，而样品溶剂中加入适量乙腈可以改善。
本文分别采用化学滴定法和HPLC法对本所12批样品总糖含量进行对比检测，结果显示两种方法的检验结果无显著差别，同样HPLC法也适用用于食品中还原糖和蔗糖等指标的测定。新建立的检测方法简单、准确、快速、重复性好，更适用于日常检验工作，并且还能同时测定五种糖的含量，对生产企业产品的质量控制具有指导意义。
参考文献：
［1］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.7-2008食品中还原糖的测定［S］.北京：中国标准出版社，2009
［2］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.8-2008食品中蔗糖的测定 ［S］.北京：中国标准出版社，2009
［3］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 20977-2007糕点通则［S］.北京：中国标准出版社，2007
［4］孙淑玲，刘坤，杨新涛.食品中总糖测定的方法与评价［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（13）：2852-2853
［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 18932.22-2003蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖含量的测定方法液相色谱示差折光检测法［S］.北京：中国标准出版社，2004
［6］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 20882-2007果葡糖浆［S］.北京：中国标准出版社，2007
Simultaneous Determination of Five Kinds of Sugars in Food by HPLC-RI
Abstract：A HPLC method for simultaneous determination of five components including fructose，glucose，sucrose，maltose，lactose in food was established.The chromatographic separation was achieved on a Inertsil NH2 colum（5μm，4.6 mm×250mm）and the column temperature was 30℃.The mobile phase was consisted of acetonitrile-water（80：20），the flow rate was 1.0 mL/min.The linear range of fructose，glucose，sucrose，maltose，lactose，were 3.911 6 μg-156.465 5 μg（r=0.999 6），3.188 7 μg-127.549 1 μg（r=0.999 6），2.698 3 μg-107.933 7 μg（r=0.999 1），4.290 9 μg-171.635 4 μg（r=0.999 8），3.730 9 μg-149.237 7 μg（r=0.999 6）.The average recoveries were 98.6%（RSD=1.28%），98.4%（RSD=1.70%），97.8%（RSD=1.63%），97.8%（RSD= 1.55%），99.2%（RSD=1.81%），respectively.
Key words：HPLC-RI；total sugar；fructose；glucose；sucrose；maltose；lactose
收稿日期：2015-09-05