超声波辅助提取-GC/MS法测定蔬菜中18种农药

邢燕，曹楷华，刘玉栋，王钟，高慧，王敏，王勤*
（淄博市疾病预防控制中心，山东淄博255026）

摘　要：开展待测农药残留样品的高效、快速检测方法研究，建立快速、准确测定蔬菜中有机氯、拟除虫菊酯农药的超声波辅助-气相色谱-质谱检测方法。用气相色谱-质谱检测方法，乙腈作为提取溶剂，超声波辅助提取，CARB/NH2固相萃取小柱净化，通过Rtx-5MS色谱柱分离检测，用外标法对蔬菜10种有机氯和8种拟除虫菊酯类农药残留进行了测定。方法灵敏准确、简便快捷，满足现阶段蔬菜中的农药残留分析要求。

关键词：有机氯农药；拟除虫菊酯农药；气相色谱-质谱；超声辅助提取；固相萃取

目前，我国农业中最常用的三大类农药为有机氯类农药、有机磷类农药和拟除虫菊酯类农药［1］。其中，有机氯类农药和拟除虫菊酯类农药作为高效广谱杀虫剂［2］在农业生产中被广泛使用。随着农药品种和用量的不断增加，使农药残留问题凸显。为了保证食品的安全，农药标准的限量要求也越来越严格，建立简单、高效和准确的农药残留检测方法成为目前分析工作者亟待解决的问题。

农药残留的检测包括样品的提取净化和上机测定。目前，有机氯类和拟除虫菊酯类农药的测定方法主要有气相色谱法（ECD）［3-6］，气相色谱-质谱法［7］、液相色谱-质谱法［8］和高效毛细管电泳法［9］等。净化技术主要包括液液萃取［10］，固相萃取［3，5］，加速溶剂萃取［7］，基质固相分散萃取［11］，凝胶色谱净化［6］等。作为传统的前处理方法——固相萃取法的回收率和富集倍数高，净化相对彻底，广泛用于农药残留的前处理过程。GB/T 5009食品卫生检验方法［12］中农药残留的前处理的固相萃取多为活性炭柱、弗罗里硅土柱和氧化铝柱［4］，这类的固相萃取小柱净化效果差，回收率低。CARB-NH2固相萃取小柱是等量的石墨化碳（CARB）和氨基（-NH2）装填而成，可以用于农残分析中色素、脂肪酸及酚类的去除。但是，在检测过程中，前处理技术并不能完全除去杂质，通过气相色谱的保留时间对农残定性时经常受到干扰，造成假阳性现象。气相色谱-质谱法利用其质谱特有的定性能力，可以很好的避免样品检测的假阳性，提高检测的准确度。本文选用气相色谱-质谱检测方法，乙腈作为提取溶剂，超声波辅助提取，CARB/NH2固相萃取小柱（500 mg/6 mL）净化，通过Rtx-5MS色谱柱分离检测，用外标法对蔬菜中α-六六六，β–六六六，γ–六六六，δ–六六六，P，P’-DDE，O，P’-DDT，P，P’-DDD，P，P’-DDT，硫丹，三氯杀螨醇，联苯菊酯，甲氰菊酯，三氟氯氰菊酯，氯菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，氰戊菊酯、溴氰菊酯10中有机氯和8中菊酯类农药残留进行了测定，方法灵敏准确、简便快捷，满足现阶段蔬菜中的农药残留分析要求。

1　试验部分

1.1　仪器与试剂

1.1.1　仪器

GCMS-QP 2010 Plus气相色谱-质谱联用仪、Rtx-5MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：日本岛津；ST 16R型高速离心机：美国Thermo Fisher公司；N-EVAPTM 112型氮吹浓缩仪：美国Organomation公司；KQ-250B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；12位SPE固相萃取仪：美国Supelco公司；CARB/NH2（500 mg/6 mL）固相萃取小柱：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.1.2　试剂

丙酮、乙腈、二氯甲烷为色谱纯试剂：购于上海安普科学仪器有限公司；纯水；α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、P，P’-DDE、O，P’-DDT、P，P’-DDD、P，P’-DDT浓度为50 μg/mL；硫丹、三氯杀螨醇、联苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯浓度均为100 μg/ mL：标准溶液购于农业部环境保护科研检测所。

1.2　仪器条件

1.2.1　质谱条件

离子化模式：电子轰击（EI）离子源；离子源温度：230℃；接口温度：250℃；离子源能量：70 eV；扫描方式：SIM。

1.2.2　色谱条件

载气为高纯氦气（99.999%）；柱流量：0.85 mL/min；毛细管柱升温程序：60℃保持1 min，以5℃/min升至290℃，保持2 min；进样口温度为260℃；不分流进样，进样体积1 μL。

表1　有机氯和拟除虫菊酯类农药的色谱-质谱参数
Table 1　Chromatographic and mass spectrometric parameters of organochlorine and pyrethroid pesticide

注：农药种类中的X-（1，2，3，4）表示不同的同分异构体，1，2，3，4为试验色谱条件下的出峰顺序。

化合物　保留时间/min　定量离子（m/z） 定性离子（m/z）α-六六六　25.900　181　183，111 β-六六六　27.167　181　183，109 γ-六六六　27.317　181　183，111 δ-六六六　28.392　181　183，111三氯杀螨醇　31.958　139　111，141硫丹-1　34.492　159　241，195 P，P’-DDE　35.417　246　248，176 O，P’-DDT　35.758　235　165，237硫丹-2　36.667　159　160，195 P，P’-DDD　36.992　235　165，237 P，P’-DDT　37.100　235　165，237联苯菊酯　40.217　181　166，165甲氰菊酯　40.475　181　97，125三氟氯氰菊酯　42.183　181　197，141氯菊酯-1　43.608　183　165，163氯菊酯-2　43.858　183　163，165氟氯氰菊酯　45.183　163　165，127氯氰菊酯-1　45.383　163　181，165氯氰菊酯-2　45.567　163　181，165氯氰菊酯-3　45.725　163　181，165氯氰菊酯-4　45.792　163　181，165氰戊菊酯-1　47.167　125　167，225氰戊菊酯-2　47.575　125　167，225溴氰菊酯-1　48.275　181　253，172溴氰菊酯-2　48.758　181　253，172

1.3　样品处理

准确称取10.0 g左右粉碎的蔬菜样品于50 mL离心管中，加入25 mL乙腈涡旋混匀，超声萃取10 min后离心分层。取15 mL上清液在40℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL丙酮-二氯甲烷（1∶1，体积比）复溶，待净化。取固相萃取小柱（CARB/NH2，500 mg/6 mL）于固相萃取仪上固定好，用5 mL丙酮-二氯甲烷（1∶1，体积比）活化小柱。当二氯甲烷液面即将到达小柱吸附层表面时，将复溶样品转入萃取柱中，用10 mL比色管接收洗脱液，再10 mL丙酮-二氯甲烷（1∶1，体积比）先后分3次淋洗小柱。洗脱液用氮气吹至近干，用丙酮定容至1.0 mL，取1.0 μL进样检测。

2　试验结果

2.1　提取溶剂的选择

农药残留检测中常用的萃取溶剂为乙酸乙酯、丙酮和乙腈［12］农药的多残留分析中，目标物结构差异大且种类多，将微量或痕量的目标物有效的提取出来是需要解决的首要问题。乙酸乙酯极性较弱，部分极性农药不能有效的提取到有机相中，提取效率差。丙酮溶解性好，对叶绿素、碳水化合物等物质的溶解性太强，共提取杂质较多。并且其与水互溶，难以实现溶剂与样品的完全分离。乙腈极性大，穿透力强，提取效率好，且乙腈提取出的色素、油脂类杂质较少，能够沉淀蛋白质等杂质［13］，因此，本试验选取乙腈作为提取溶剂。2.2　超声波提取时间的选择

比较了不同提取时间5、10、l5、20 min对农药残留提取效果的影响。试验结果表明，超声波辅助提取10 min可保证良好的提取效果，重复性较好。提取时间大于10 min以后，回收率没有明显变化，而且由于提取时间的延长，提取液中杂质含量增加，样品重现性受到影响。因此本试验选择提取时间为10 min，既能保证良好的提取效果和较少的杂质干扰，又节省处理时间。

2.3　样品净化柱的选择

叶绿素、碳水化合物、蛋白质和脂肪是蔬菜农药残留检测中的主要干扰物质，CARB-NH2小柱上层主要成分是活性碳，除去色素的效果较好，下层NH2基能和碳水化合物、蛋白质以及脂肪中的相关基团（-OH、-NH2基等）形成氢键而去除干扰化合物；二者结合可有效除去色素、碳水化合物、蛋白质和脂肪等杂质。故本试验选用CARB/NH2小柱作为样品净化柱对样品进行前处理。

2.4　标准曲线及检出限

用丙酮为溶剂，配制有机氯农药、拟除虫菊酯类农药标准系列，用Rtx-5气相色谱柱，按最佳分析条件对农药标准溶液进行测定，标准的总离子流图如图1所示。以峰面积对浓度作曲线，求得标准曲线方程及相关系数，列于表2中。以仪器3倍噪声值表示方法的检出限，按取样量按10.0 g计算其最低检出浓度，单位为mg/kg，结果一并列于表2中。

图1　Rtx-5色谱柱对18种有机氯和拟除虫菊酯类农药的SIM图（混合标准浓度0.5 μg/mL）
Fig.1　Standard SIM chromatogram for organochlorine and pyrethroid pesticide residues separated by Rtx-5 column

通过表2中数据可以看出，在试验浓度范围内，目标物浓度与峰面积线性关系良好，相关系数在0.997～0.999之间，检出限为1.0×10-4mg/kg～1.0×10-3mg/kg，18种有机氯和拟除虫菊酯类农药均有较好的线性及较高的灵敏度。

2.5　方法回收率和精密度

以已知不含农药残留的白菜样品为基质做加标回收试验，标准加入量为0.15 μg和1.0 μg，加入浓度为0.015 mg/kg和0.1 mg/kg。按试验方法提取、净化和检测，以峰面积计算各种农药的回收率。每个加标量做6个平行样，计算各种农药的平均回收率及相对标准偏差，其结果见表3。

由表3可知，18种组分的回收率在79%～108%之间，满足分析要求；平行样的相对偏差满足检测结果。

2.6　样品测定

对70份市售蔬菜样品进行检测，联苯菊酯的检出率为17.1%，三氟氯氰菊酯的检出率为5.7%，氰戊菊酯的检出率为8.6%，其它组分均未检出。共进行了5组基体加标和5组空白加标分析，加标回收率均在合理范围内，该方法适合批量蔬菜样品中有机氯、拟除虫菊酯农药的分析测定。

表2　有机氯和拟除虫菊酯类农药的标准曲线方程及检出限
Table 2　Standard curve equation and detection limit for organochlorine and pyrethroid pesticide residues

化合物　浓度范围/（μg/mL）标准曲线方程Y=A+BX　相关系数R2　　检出限/ （mg/kg）A B α-六六六　0.001～0.5　8 187.5　-22.5　0.997　＜1.0×10-3β-六六六　0.001～0.5　5 923.3　8.261　0.999　＜1.4×10-3γ-六六六　0.001～0.5　7 044.7　-39.5　0.999　＜1.1×10-3δ-六六六　0.005～0.5　5 014.3　-245.8　0.999　＜1.8×10-3三氯杀螨醇　0.005～0.5　2 8694.5　-123.5　0.999　＜2.0×10-4硫丹-1　0.005～0.5　2 104.7　18.3　0.999　＜4.0×10-3P，P’-DDE　0.001～0.5　1 8432.4　18.8　0.999　＜5.0×10-4O，P’-DDT　0.001～0.5　8 873.3　46.9　0.999　＜9.0×10-4硫丹-2　0.005～0.5　1 060.0　84.0　0.998　＜1.0×10-3P，P’-DDD　0.001～0.5　32 121.5　35.1　0.998　＜2.3×10-4P，P’-DDT　0.001～0.5　35 090.4　-102.1　0.999　＜2.3×10-4联苯菊酯　0.001～0.5　94 926.9　185.8　0.999　＜1.0×10-4甲氰菊酯　0.005～0.5　13 030.5　-31.683　0.999　＜5.0×10-4三氟氯氰菊酯　0.001～0.5　19 621.1　-11.3　0.999　＜4.0×10-4氯菊酯-1　0.001～0.5　33 462.0　-30.2　0.999　＜2.5×10-4氯菊酯-2　0.001～0.5　27 484.7　-0.1　0.999　＜3.0×10-4氟氯氰菊酯　0.001～0.5　9 631.8　20.1　0.998　＜8.0×10-4氯氰菊酯-1　0.005～0.5　3 050.8　36.5　0.998　＜2.0×10-3氯氰菊酯-2　0.005～0.5　4 266.0　18.4　0.999　＜2.0×10-3氯氰菊酯-3　0.005～0.5　2 950.5　-1.7　0.998　＜2.0×10-3氯氰菊酯-4　0.005～0.5　3 828.9　-7.8　0.998　＜2.0×10-3氰戊菊酯1　0.001～0.5　13 722.0　15.1　0.998　＜6.0×10-4氰戊菊酯-2　0.001～0.5　8 202.0　18.3　0.999　＜1.0×10-3溴氰菊酯-1　0.01～0.5　1 030.0　-22.6　0.999　＜1.7×10-3溴氰菊酯-2　0.01～0.5　5 980.9　-2.9　0.998　＜3.0×10-4

表3　有机氯、拟除虫菊酯类农药的加标回收率及相对标准偏差
Table 3　Recoveries and the relative standard deviations for organochlorine and pyrethroid pesticide residues

化合物　添加浓度（0.015 mg/kg）　添加浓度（0.1 mg/kg）　化合物　添加浓度（0.015 mg/kg）　添加浓度（0.1 mg/kg）回收率/%　RSD/%　回收率/%　RSD/%　回收率/%　RSD/%　回收率/%　RSD/% α-六六六　91　1.2　92　0.77　三氟氯氰菊酯　101　0.75　103　0.96β–六六六　105　2.0　89　0.54　氯菊酯1　97　0.93　104　1.6γ–六六六　87　3.1　102　0.69　氯菊酯2　108　0.89　83　2.4δ–六六六　92　2.9　101　1.3　氟氯氰菊酯　93　0.83　93　2.8三氯杀螨醇　79　1.0　83　2.1　氯氰菊酯1　87　1.9　92　2.1硫丹1　86　0.89　80　2.2　氯氰菊酯2　89　2.5　85　0.69 P，P’-DDE　90　1.2　89　0.98　氯氰菊酯3　84　2.9　108　0.78 O，P’-DDT　85　1.1　105　1.8　氯氰菊酯4　80　3.5　87　1.3硫丹2　80　0.76　94　1.0　氰戊菊酯1　88　3.0　93　1.6 P，P’-DDD　83　0.81　92　1.9　氰戊菊酯2　93　2.4　104　1.9 P，P’-DDT　84　0.50　81　0.56　溴氰菊酯1　95　2.3　90　2.9联苯菊酯　93　1.4　91　0.89　溴氰菊酯2　91　0.75　83　4.0甲氰菊酯　94　1.6　93　1.3

3　结论

本研究充分利用气相色谱-质谱在定性定量方面的优势，检测结果灵敏、准确、重现性好，满足蔬菜中农药残留限量标准的要求，适用于蔬菜中多种有机氯类、拟除虫菊酯类农药的同时测定。

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Ultrasonic Assisted Extraction-Gas Chromatography-Mass Spectrometry Method for the Determination of 18 Kinds of Pesticides in Vegetables

XING Yan，CAO Kai-hua，LIU Yu-dong，WANG Zhong，GAO Hui，WANG Min，WANG Qin*
（Zibo Municipal Center for Disease Control and Prevention，Zibo 255026，Shandong，China）

Abstract：The research was carried out for detecting the pesticide residue in samples efficiently and rapidly. The determination of ultrasonic assisted extraction-gas chromatography-mass spectrometry method for organochlorine and pyrethroid pesticides in vegetable was established.10 kinds of organochlorine and 8 kinds of pyrethroid pesticide were extracted with acetonitrile；ultrasonic assisted extraction；purified with CARB/NH2solid phase extraction；separated with Rtx-5MS column，detected with gas chromatography-mass spectrometry by external standard method.The method is sensitive，accurate，simple and fast，and can meet the requirements of pesticide residues in vegetables.

Key words：organochlorine pesticides；pyrethroid pesticides；GC-MS；ultrasonic assisted extraction；solidphaseextraction

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.15.039

基金项目：山东省自然科学基金项目（ZR2015PH035）；山东省医药卫生科技发展计划项目（2013WS0028）；淄博市科技发展计划项目（2012GG01283）

作者简介：邢燕（1982—），女（汉），主管技师，博士，从事食品、环境中有机污染物检测研究。

*通信作者：王勤，女，主任技师，从事食品、环境中有机污染物检测研究。

收稿日期：2015-08-18