摘 要：建立鸡肉中常见3种致病菌即小肠耶尔森氏菌、大肠杆菌O157：H7和沙门氏菌的多重PCR（聚合酶链式反应）检测方法。方法：分别选择小肠耶尔森氏菌、沙门氏菌和大肠杆菌O157：H7基因组中高特异性的ail基因、invA基因和ECs3032，设计并筛选具有高特异性的引物用于PCR（聚合酶链式反应）扩增。建立一种此3种致病菌的三重PCR检测方法，并通过人工污染实验对该法进行验证。结果：3对引物能特异地扩增出251、347、469 bp的目的条带；灵敏度：对这3种致病菌的单菌培养物检测灵敏度均为101CFU/mL。同时检测3种菌的灵敏度为103CFU/mL。结论：该检测方法高效、精确、特异性强、灵敏度高，6 h～8 h内可同时快速检测多种致病菌，节省了大量时间。在实际检测中具有很好的实用价值和开发前景，可在食品检测和临床检验等领域大力推广。
关键词：多重PCR；小肠耶尔森氏菌；大肠杆菌O157：H7；沙门氏菌
食品安全问题一直是一个世界范围内的公共卫生安全问题。食源性疾病更是越来越引起国际社会的广泛关注。导致食源性疾病感染的因素大致可以分为两大类，一类是食物中毒以及农药超标，不合理使用添加剂等，另一类是食品致病菌污染造成的。后者感染者集中，数量大，占食源性疾病感染者的70%。且微生物在环境中广泛存在、不宜发现，这就导致了致病因素是不可避免的，只能通过有效检测手段控制致病菌污染。因此，检测与鉴定食品中病原微生物显得尤为重要。
沙门氏菌、小肠耶尔森氏菌和大肠杆菌O157：H7是常见的引起肉制品污染的重要致病菌[3]。可通过日常饮食导致人类细菌性食物中毒，感染疾病。传统的国标检测法一直被认为是病原菌检测方法的金指标。但费时费力，一般需4 d～7 d。近年来兴起的PCR技术以其特异性强、敏感性好，方便、快速等优点逐渐应用于食品药品医学等检验领域。但PCR方法每次试验只能特异性的检测一种病原菌，而实际样品中往往存在种类繁多的病原细菌，涉及不同种和型别。多重PCR是在普通PCR基础上针对这一不足改进并发展起来的，在同一个反应中同时完成多个基因扩增的一种快捷检测方法[1]。
1.1.1 菌株
收集了小肠耶尔森杆菌（CMCC52302）、肠炎沙门氏菌（CMCC50041）、出血性大肠埃希氏菌EHEC O157：H7（IQCC10102）、金黄色葡萄球菌（ATCC14458）、单核细胞增生李斯特氏菌（CMCC54001）、副溶血性弧菌（CMCC20001）、阪崎肠杆（ATCC29544）、普通变形杆菌（CMCC49027）、福氏志贺氏菌（CMCC51571）、肉毒梭菌（CMCC64451）、蜡样芽孢杆菌（CMCC63302）共 11株菌。均来源于中国医学细菌保藏管理中心；
1.1.2 仪器与设备
PCR仪：Whatman T Gradient基因扩增仪；电泳仪（DXY-33A型）：北京市六一厂生产；凝胶成像系统（UviteeBTS-20.M型）：英国UVItec公司。
1.1.3 引物及目的基因的选择
引物由上海生工生物工程公司合成；引物序列如表1。
表1 引物序列
Table 1 The primer sequences
菌种 目的基因 PCR引物序列（5’-3’） 目的片段大小小肠耶尔森氏菌ail 5'CGCTCCGAGTGAAAGTAGT3' 253 bp 5'CGTTGATGCGGAAAGATG3'大肠杆菌O157：H7 ECs3032 5'ACTAATGCGAATGGGGGTA3' 345 bp 5'TGGTCGGCAGTCTGAAAAT3'沙门氏菌 invA 5'ATGAAGAGCGGGAGAAAC3' 468 bp 5'TCAAGGCTGAGGATGGTAT3'
1.2.1 病原菌同时快速增殖
将所选菌株接种在LB肉汤斜面培养基，放置于36℃培养箱中培养12 h～18 h使其增殖[2]。
1.2.2 靶基因选取与引物设计
根据国内外现有文献报道[3-7]，小肠耶尔森氏菌的ail基因、沙门氏菌的invA基因和大肠杆菌O157：H7基因组中的ECs3032序列[3]是具有高特异性的基因序列，用引物设计软件Primer 5.0，分别设计1对引物，由上海生工合成。
1.2.3 DNA模板的制备
采用基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，存于-20℃备用。
1.2.4 聚合酶链反应
1.2.4.1 多重PCR扩增反应体系确立及条件优化
针对多重PCR关键影响因素，先设计正交实验大致确定其扩增条件的范围，再用单实验因素对多重PCR反应体系及循环参数进行进一步优化，以确定该三重PCR的最佳反应体系[8]。
1.2.4.2 特异性检测
分别提取其它11株菌株的基因组DNA，添加3对引物和最佳反应体系进行PCR扩增，后用琼脂糖凝胶（2%）电泳检测。
1.2.4.3 灵敏度试验
将3种致病菌标准菌株接种至LB液体培养基中36℃增菌24 h，用生理盐水对菌液进行10倍梯度稀释，得到10-1～10-7倍稀释的菌液。同时采用稀释平板计数法，测定其纯培养物活菌数；每个稀释度分别取1 mL菌液采用试剂盒法提取细菌基因组DNA，进行PCR反应。
1.2.4.4 人工污染试验
将沙门氏菌、小肠耶尔森氏菌和大肠杆菌O157：H7接种至LB液体培养基36℃增菌24 h分别以1∶9的比例接种到从当地超市购买的鸡肉制成的生理盐水匀浆中。该鸡肉经国标法检测证实不含有沙门氏菌、小肠耶尔森氏菌和大肠杆菌O157：H7。用生理盐水将鸡肉匀浆人工污染后再进行10倍梯度稀释，此稀释菌液中取1 mL加入至9 mL的灭菌生理盐水中制成梯度稀释度灭菌鸡肉匀浆。
最终确定PCR反应体系包括：10×PCR buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mmol/L）1.5 μL，模板1.5 μL，dNTPs（25 mmol/L）2 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 1.4 μL，ddH2O 补齐至 25 μL。预变性94℃ 5 min；变性 94℃1 min、退火 54.1℃ 1 min、延伸72℃2 min，共进行30个循环；72℃延伸10 min；于4℃下保存。
采用试剂盒提取11株致病菌的基因组DNA，并进行随机3株混合，按优化后的最佳PCR反应条件扩增，产物用琼脂糖凝胶（2%）电泳检测，结果如图1。
结果显示，3株目的菌均出现特异性条带，其它非目的菌均未出现特异性条带。
扩增结果分别为251、347、469 bp的产物片段与预期大小吻合。测序结果显示：沙门氏菌扩增片段经与GenBank中invA基因序列比对，同源性达到99.15%；大肠杆菌 O157：H7扩增片段经与 GenBank中ECs3032基因序列nuc比对，同源性达99.71%；小肠结肠炎耶尔森氏菌扩增片段经与GenBank中ail基因序列比对，同源性达到97.61%。可见这套PCR引物具有很好的特异性。
图1 多重PCR反应特异性
Fig.1 The specificity of multiplex PCR
M.DNA marker；1.蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，副溶血弧菌；2.金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单增李斯特氏菌3.蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌；4.蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、普通变形杆菌；5.小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、普通变形杆菌；6.出血性大肠埃希氏菌O157：H7、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌；7.小肠结肠炎耶尔森氏菌、出血性大肠埃希氏菌O157：H7、沙门氏菌；8.小肠结肠炎耶尔森氏菌、沙门氏菌、副溶血弧菌；9.单核细胞增生李斯特氏菌、出血性大肠埃希氏菌O157：H7、沙门氏菌；10.小肠结肠炎耶尔森氏菌、出血性大肠埃希氏菌O157：H7、阪崎肠杆菌。
2.3.1 三重PCR检测单一菌株的灵敏度
将培养好的沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠杆菌O157：H7菌液分别进行梯度稀释，再提取模板DNA单独进行三重PCR的扩增，确定三重PCR检测单一致病菌的灵敏度。结果由图2～图4所示，三重PCR检测这3种菌株中单菌菌液的灵敏度均为101CFU/mL。
图2 沙门氏菌的单重PCR灵敏度
Fig.2 The PCR sensitivity of Salmonella
M.DNA marker；1.沙门氏菌DNA模板浓度为108CFU/mL；2.沙门氏菌DNA模板浓度为107CFU/mL；3.沙门氏菌DNA模板浓度为106CFU/mL；4.沙门氏菌DNA模板浓度为105CFU/mL；5.沙门氏菌DNA模板浓度为104CFU/mL；6.沙门氏菌DNA模板浓度为103CFU/mL；7.沙门氏菌DNA模板浓度为102CFU/mL；8.沙门氏菌DNA模板浓度为101CFU/mL；9.沙门氏菌DNA模板浓度为100CFU/mL；10.阴性对照；11.阳性对照。
图3 大肠杆菌O157：H7的单重PCR灵敏度
Fig.3 The PCR sensitivity of E.coli O157：H7
M.DNA marker；1.大肠杆菌O157：H7DNA模板浓度为108CFU/mL；2.大肠杆菌O157：H7DNA模板浓度为107CFU/mL；3.大肠杆菌O157：H7DNA 模板浓度为 106CFU/mL；4.大肠杆菌 O157：H7DNA模板浓度为105CFU/mL；5.大肠杆菌O157：H7DNA模板浓度为104CFU/mL；6.大肠杆菌O157：H7DNA模板浓度为103CFU/mL；7.大肠杆菌O157：H7DNA 模板浓度为 102CFU/mL；8.大肠杆菌O157：H7DNA模板浓度为 101CFU/mL；9.大肠杆菌 O157：H7DNA模板浓度为100CFU/mL；10.阴性对照；11.阳性对照。
图4 小肠结肠炎耶尔森氏菌的单重PCR灵敏度
Fig.4 The PCR sensitivity of Yersinia enterocolitica
2.3.2 三重PCR检测3种病原菌的灵敏度
选取的3种病原菌36℃培养过夜，菌液等体积混合后，制成系列梯度稀释液，提取基因组DNA按优化好的三重PCR最佳反应体系进行扩增，确定三重PCR同时检测3种致病菌的灵敏度。结果如图5所示，同时检测3种致病菌的灵敏度为103CFU/mL。
2.3.3 人工污染样品确定检出限
对本地市场购买的鸡肉加热灭菌，PCR检测沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌O157：H7三种病原菌，显示阴性。人工添加菌液进行多重PCR检测，结果显示：建立的三重PCR检测方法能有效地扩增出沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌O157：H7三种病原菌的目的基因片段，如图6所示。
图5 多重PCR的灵敏度结果
Fig.5 The PCR sensitivity of multiplex PCR
M.DNA marker；1.108CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；2.107CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；3.106CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；4.105CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；5.104CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；6.103CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；7.102CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；8.101CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；9.100CFU/mL混合菌液提DNA模板PCR扩增；10.阴性对照；11.阳性对照。
图6 多重PCR检测鸡肉中3种病原菌的检出限
Fig.6 The detection limit of three kinds of pathogenic bacteria detection of multiple PCR in chicken
M.DNA marker；1.人工添加3种致病菌为108CFU/mL；2.人工添加三种致病菌为107CFU/mL；3.人工添加3种致病菌为106CFU/mL；4.人工添加3种致病菌为105CFU/mL；5.人工添加三种致病菌为104CFU/mL；6.人工添加三种致病菌为103CFU/mL；7.人工添加3种致病菌为102CFU/mL；8.人工添加3种致病菌为101CFU/mL；9.人工添加3种致病菌为100CFU/mL；10.阴性对照；11.阳性对照。
人工添加经增殖培养后并验证活菌数的菌液于该鸡肉样品，结果显示最低检出的样品分别为：沙门氏菌和大肠杆菌O157：H7为103CFU/mL的样品，小肠结肠炎耶尔森氏菌可达102CFU/mL的样品。
本研究，旨在建立一种三重PCR检测沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和大肠杆菌O157：H7的方法。选择检测目的基因直接影响PCR的特异性和敏感性，引物的设计并筛选更是决定PCR试验成功与否的关键性因素[9-12]，好的引物可以降低和避免背景及非特异性产物的产生。本试验以介导小肠结肠炎耶尔森菌的侵袭性的黏附侵袭位点基因[6]的ail基因、只存在于致病性沙门菌中的独特保守基因序列[5]—invA基因和大肠杆菌O157：H7基因组中的ECs3032序列[4]为目的基因（有试验表明大肠杆菌O157：H7基因组中的ECs3032序列是具有种群特异性的转录调控子序列[4]），故本次试验采用此序列设计引物。
本研究建立的沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和小肠耶尔森氏菌多重PCR检测方法，实现了在同一个反应中同时完成多个基因的扩增。该检测方法高效、精确、特异性强、灵敏度高，在日常食品检测中，具有很好的实用价值。
参考文献：
[1] 凌霞,张敬平,肖勇,等.食源性致病菌多重PCR快速检测方法建立与应用[J].微生物学杂志,2010,30(4)：39-43
[2] 郭洪波,邓景致.九种动物性食品致病菌通用前增菌方法的研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2010,22(3)：61-64
[3] 宋艳,李建林,郑铁松.食源性致病菌PCR检测中常用的靶基因及其参考引物[J].食品工业科技,2011,32(1)：371-376
[4] 巢强国,杨学明,葛宇.PCR法检测食品中大肠杆菌O157：H7[J].食品科学,2010,31(8)：212-215
[5] 李莉,蒋作明.PCR技术在食品沙门氏菌检测中的应用[J].食品科技,2002(4)：60-62
[6] 马宏伟,邹清杰,张箭,等.多重聚合酶链反应检测食品中致病性小肠结肠炎耶尔森菌和伤寒沙门氏菌[J].延边大学医学学报,2001,24(3)：176-179
[7] 金慧英,陈华标.分子生物学技术在大肠杆菌O157：H7检测中的应用[J].中国人兽共患病杂志,2002,18(5)：87-89
[8] 郝玉琴,孙皆宜,李艾,等.正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究[J].安徽农业科学,2010,38(2)：602-605
[9]蒋鲁岩,陈光哲.PCR技术同步检测动物产品中的4种致病菌[J].检验检疫科学,2003,13(4)：7-10
[10]赵红庆,苑锡铜,黄留玉.多重PCR技术在病原检测中的应用[J].生物技术通讯,2007(5)：863-865
[11]Abbs S,M Bobrow.Analysis of quantitative PCR for the diagnosis of deletion and duplication carriers in the dystrophin gene[J].Med.Genet,1992(29)：191-196
[12]王慧,朱瑞良,谭燕玲,等.多重PCR检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用[J].中国农业科学,2011,44(11)：2334-2340
Multiple PCR Rapid Detection for Three Pathogenic Bacteria in Chicken
Abstract：A multiplex PCR method to detecte the Yersinia enterocolitica，E.coli O157：H7 and Salmonella in chicken meat was Established.The ail gene sequence of Yersinia enterocolitica，the ECs3032 gene sequence of E.coli O157：H7 and the invA gene sequence of Salmonella were designed for primers and chose the high specific primers.A multiplex PCR method and demonstrated the method by artificial contamination experiments was Established.The primers amplified 251bp,347bp,469bp target band specifically.The sensitivity of single bacterial detection was 101CFU/mL.The sensitivity of all bacterial was 103CFU/mL.The method was efficient,accurate,high specificity and sensitivity.The method which detect a variety of pathogens costs 6 h-8 h and saves a lot of time.The method had good practical value and development future in the actual testing.It should promote vigorously in the field of food testing and clinical examination.
Key words：multiple PCR；Yersinia enterocolitica；E.coli O157：H7；Salmonella
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.036
收稿日期：2016-01-03