表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions
时间/min 流动相A 20 mmoL/L醋酸铵水溶液/% 流动相B甲醇/%90 10 0.5 90 10 10.5 10 90 13.5 10 90 15 90 10 0
摘 要：建立超高效液相色谱串联质谱法测定花生油中黄曲霉毒素B1含量的方法。与液相色谱法相比较，无需衍生化，避免了柱前和柱后衍生受衍生产物的不稳定性、衍生剂的浓度、温度、反应时间和色谱峰展宽等因素的影响。采用多反应监测（MRM）方式进行检测，黄曲霉毒素B1在1.0 ng/mL～20 ng/mL浓度范围具有良好的线性关系，相关系数（r2）为0.9991，在空白样品中加入2.0μg/kg和16.0μg/kg两个浓度水平的黄曲霉毒素B1，平均回收率在89.5%～93.1%，相对标准偏差（RSD）在4.3%～5.8%，定量限为0.3μg/kg，仪器精密度试验结果相对标准偏差为1.3%。
关键词：UPLC-MS/MS；黄曲霉毒素B1；花生油
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）是由黄曲霉和寄生曲 霉等真菌产生的次级代谢产物，是一类结构相似和致毒基团相同的二氢呋喃香豆素类代谢产物[1]。目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有20余种，常见的有黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q1 等[2]。其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）被认定为是毒性和致癌性最强的物质，它主要引起人的肝脏损害，发生肝炎、肝硬化、肝坏死等。花生油是通过机械压榨或者有机溶剂浸出的液体经过加工得到的油脂，是人类膳食的主要组成部分和人类基本生命活动的营养源。用于生产花生油的原料，在生产、加工、运输、贮藏等各个环节均可能受到黄曲霉毒素污染，从而影响花生油的品质。我国GB 2761-2011《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定花生油中黄曲霉毒素B1的最高限量为20 μg/kg，所以建立准确、快速的测定花生油中黄曲霉毒素B1的检测方法，对维护人们的健康具有重要的意义[3-5]。
目前，黄曲霉毒素B1的测定方法主要有薄层色谱扫描法（TLCS）、酶联免疫法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱法（GC-MS）、液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）等检测方法[6-11]。薄层色谱法（TLC）是测定黄曲霉毒素定性和半定量的经典方法，该法操作烦琐、灵敏度低、定量不够准确，近年来应用较少；ELISA法适用于大批量样品的快速筛查，具有检测速度快、特异强等优点，但检测结果易出现假阳性，且不能准确定量；气相色谱-质谱联用法存在前处理步骤繁琐、有机试剂消耗量大、测定周期长等缺点；高效液相色谱荧光法虽然是现行较常见的方法之一，但柱前或柱后衍生需要成套设备，易受衍生剂浓度、温度和反应时间的影响，易对操作者健康和环境造成影响；LC-MS/MS法能够提供结构信息，无需衍生化反应，具有准确、高效、灵敏度等特点，满足食用花生油中黄曲霉毒素B1的含量的测定。
花生油：购置于贵阳市超市；质量浓度为100μg/mL黄曲霉毒素B1标准溶液：北京泰乐祺科技有限公司；水为超纯水：化学与生命科学学院化学实验室制备；甲醇、醋酸铵：均为色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司。
吐温-20/磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）的配制：称取 8.0 g氯化钠，0.2 g氯化钾，1.2 g磷酸氢二钠和0.2 g磷酸二氢钾溶于990 mL水中，用盐酸水溶液（体积比=50∶50）调节溶液的pH值至7.0，加入1.0 mL吐温-20，用超纯水定容至1.0 L，混匀。
Ultimate 3000超高压液相色谱仪、TSQ Quantum ultra三重四极杆质谱仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Sigma 3-18K台式高速离心机：Sigma中国有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司；艾科浦Aquaplus超纯水机：上海百特科技有限公司；黄曲霉毒素B1免疫亲和柱：北京泰乐祺科技有限公司。
1.3.1 样品的提取与净化
1）样品的提取：准确称取5.00 g（精确至0.01 g）花生油于50 mL离心管中，加入2 gNaCl和25 mL甲醇-水溶液（体积比=7∶3），涡旋振荡提取1 min，定量滤纸过滤，准确吸取5.00 mL滤液，用吐温-20/PBS缓冲溶液稀释至30 mL，混匀，稀释提取液待净化。
2）净化洗脱：待黄曲霉毒素免疫亲和柱液体流至筛板时，将上述稀释提取液过黄曲霉毒素免疫亲和柱，用10 mL吐温-20/PBS缓冲溶液淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，排干免疫亲和柱中的水后，用3 mL甲醇分3次洗脱免疫亲和柱，收集的洗脱液于40℃下氮吹至干，加入20 mmoL/L醋酸铵水溶液∶甲醇（体积比=90∶10）溶液1.0 mL，溶解残留物，涡旋混均10 s，过0.22 μm的滤膜，上机测定。
1.3.2 色谱条件
超高效液相色谱条件：Hypersil Gold-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm×1.9 μm），柱温 30℃，进样体积10 μL，流动相20 mmoL/L醋酸铵水溶液-甲醇，流速0.3 mL/min，梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions
时间/min 流动相A 20 mmoL/L醋酸铵水溶液/% 流动相B甲醇/%90 10 0.5 90 10 10.5 10 90 13.5 10 90 15 90 10 0
质谱条件：电喷雾（electronic spray ion，ESI）离子源，喷雾电压3 500 V，毛细管温度300℃，蒸发温度270 ℃，鞘气 270 kPa，辅助气 104 kPa，碰撞气 0.2 Pa，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）优化参数见表2。
表2 质谱参数
Table 2 The parameters of mass spectrum
注：*为定量离子。
化合物监测离子对/（m/z）碰撞能量/eV透镜电压/V黄曲霉毒素素B1（AFB1）313.1>241.1 39 122 313.1>285.1* 21 122
1.3.3 标准曲线的绘制及样品中黄曲霉毒素的检测
将标准储备液用初始流动相稀释成1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 ng/mL 的标准系列溶液，在 1.3.2 色谱条件下进行分析，以黄曲霉毒素B1质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线回归方程。
将样品的峰面积带入标准曲线回归方程，计算样品中黄曲霉毒素B1的含量。
1.3.4 精密度及准确度试验
取质量浓度为8.0 ng/mL黄曲霉毒素B1标准溶液在1.3.2色谱条件下进行分析，连续测定6次，计算仪器精密度相对标准偏差。
在5.00 g空白花生油样品中添加黄曲霉毒素B1标准溶液，使添加水平分别为2、16 μg/kg低、高两个浓度水平，按照1.3.1样品提取与净化方法进行样品前处理，在1.3.2色谱条件下进行分析，每个添加水平平行测定6份，计算方法平均回收率和相对标准偏差。
按照标准曲线的制作方法，以黄曲霉毒素B1质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。
图1 黄曲霉毒素B1标准曲线
Fig.1 Standard curve of aflatoxin B1
由图1可知，黄曲霉毒素B1标准曲线的线性回归方程为 y＝51 431.8x+7 106.4（r2＝0.999 1）。结果表明，二者线性关系良好。以10S/N计算方法的定量限为0.3 μg/kg。
向空白花生油样品中添加低、高两个浓度水平的黄曲霉毒素B1，每个添加量做6次平行样，方法的平均回收率结果见表3。
表3 方法的加标回收率及精密度
Table 3 The recovery and precision of the method
化合物名称 添加量/（μg/kg）测定值/（μg/kg） 平均回收率/% RSD/%黄曲霉毒素B1 2 1.79 89.5 5.8 16 14.9 93.1 4.3
由表3可知，方法的平均回收率在89.5%～93.1%，相对标准偏差（RSD）在4.3%～5.8%之间，结果表明该方法准确度较高。
取质量浓度为8.0 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液在1.3.2色谱条件下进行分析，连续测定6次，黄曲霉毒素B1测定结果相对标准偏差（RSD）为1.3%，结果表明仪器精密度较好。
黄曲霉毒素B1测定一般采用正离子模式。本试验采用三通方式对目标化合物进行全扫描，找出准分子离子峰（M+H），通过改变试验条件（毛细管电压、透镜电压、毛细管温度、蒸发温度等），使母离子最大效率通过一级质谱进入二级质谱，并以此准分子离子峰为母离子进行轰击，进行二级质谱扫描，找出2个信号较强的碎片离子构成监测离子对，选择不同的碰撞能量和滞留时间优化特征离子（见表2），控制特征碎片离子的丰度，获得了较好的选择性，增加定性的可靠性和提高了定量准确度。
在流动相中加入适量的甲酸、乙酸和低浓度的挥发性缓冲盐得到更加丰富的离子碎片信息，改善峰形，提高测定的灵敏度。本研究选择甲醇-20 mmol/L醋酸铵水溶液作为流动相，进行二元梯度洗脱，黄曲霉毒素B1标准和样品的MRM见图2。
图2 黄曲霉毒素B1标准（A）和样品（B）的MRM图谱
Fig.2 MRM chromatograms for Aflatoxin B1standard（A）and samples（B）
国标GB/T 18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光法》测定植物油中B1规定称取25 g植物油加入125 mL甲醇-水（7∶3）提取植物油中的黄曲霉毒素B1，称样量较大，所需的提取溶剂的量较大，成本较高。植物油样本的均匀性较好，本文将称样量缩减为5.00 g，提取剂的消耗量较少，对同一阳性植物油样品中B1的测定测定结果与国标测定结果吻合。
黄曲霉毒素B1在紫外光的激发下，产生较强的荧光，可以使用荧光检测器进行检测，但接触水后，发生荧光淬灭现象，荧光基本消失，很难用液相色谱检测出来，所以需采用衍生方法使黄曲霉B1的荧光性增强。国标GB/T 18979-2003《食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光法》使用柱后碘衍生法测定黄曲霉毒素B1含量，需要柱后衍生泵，操作繁琐，易受衍生剂浓度、温度和反应时间等条件的的影响，所以使用较少。光化学衍生器不需要任何化学试剂，直接连接于色谱柱与荧光检测器之间，操作简单，成为基层实验室检测黄曲霉毒素B1检测的主流方法，但柱后峰形展宽较明显。本研究采用超高效液相色谱串联质谱法测定花生油中黄曲霉毒素B1的含量，色谱峰较窄、无需衍生化、灵敏度较高。对同一阳性花生油样品进行前处理后，分别使用超高效液相色谱串联质谱和光化学衍生液相色谱法进行测定，测定结果分别为13.2、12.8 μg/kg，结果相对标准偏差1.54%，表明超高效液相串联质谱法能满足花生油中黄曲霉毒素B1的测定。
基质是样品中待测物以外的组分，对分析物的测定过程有显著干扰，并影响质谱定量准确性及检测灵敏度。存在基质效应时，质谱定量常采用空白基质校正曲线、同位素内标法或者两者结合的方法。空白基质校正曲线可一定程度上减小基质效应对定量准确性的影响，但获得与待测样品完全一样的空白基质较难，同位素内标物一般比较昂贵。通过改变仪器条件和改善前处理可以减小基质效应[12]。本研究用按照1.2节处理空白花生油样品提取基质和初始流动相配制成浓度均为 1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 ng/mL 空白基质校准曲线和溶剂校准曲线，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，利用空白基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值反映基质干扰的强弱，两者的斜率比值为0.983，表明基质对黄曲霉毒素B1测定产生抑制作用，但抑制效果不明显，实际定量可采用溶剂校准曲线。说明采用免疫亲和层析柱净化去除油脂效果较好，可较大程度减小测定液的基质效应。
对不同超市随机购买的20份花生油样本中黄曲霉毒素B1进行了测定，其中12份未检出黄曲霉毒素B1，8 份检出黄曲霉毒素 B1，含量在 0.61 μg/kg～12.3 μg/kg之间，均未超过国家标准限值。
本研究采用了免疫亲和柱净化-超高效液相色谱串联质谱法测定花生油中黄曲霉毒素B1的含量。使用超高液相检测灵敏度比普通高效液相色谱法高，消耗的有机溶剂少，检测速度快，适用于大批量样品的检测。使用高灵敏度的质谱检测器，有效的减少基质对黄曲霉毒素B1测定的干扰，避免了柱前和柱后化学衍生法受衍生剂的浓度、温度、反应时间、色谱峰展宽等因素的影响。该方法专属性强、线性范围宽、平均回收率为89.5%～93.1%，标准偏差为4.3%～5.8%，精密度试验结果相对标准偏差为1.3%，该方法具有准确、特异性强、灵敏度高、重现性好、回收率高等优点，满足花生油中黄曲霉毒素B1的测定要求。
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Determination of Aflatoxin B1in Peanut Oil by UPLC-MS/MS
Abstract：Aflatoxin B1contents in peanut oil were detected by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Compared with using liquid chromatography only，the method avoided derivative product instability，derivatizing agent concentration，derivatization temperature，reaction time，peak broadening and other influences in pre-colum and post-column derivatization.Multiple reaction monitoring（MRM）mode was used in detection，the results showed that aflatoxin B1had a good linear correlation in 1.0 ng/mL to 20 ng/mL concentration range with coefficient （r2）of 0.999 1，two levels of aflatoxin B1at 2.0 μg/kg and 16.0 μg/kg were added in blank samples with the average recovery between 89.5%and 93.1%，the relative standard deviation（RSD）between 4.3%and 5.8%，the limit of quantification was 0.3 μg/kg，relative standard deviation for instrument precision was 1.3%.
Key words：UPLC-MS/MS；aflatoxin B1；peanut oil
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.029
基金项目：教育部生物资源科学专业综合改革试点项目（2012287）；贵州省科学技术基金（黔科合J字[2013]2246号）
收稿日期：2016-03-12