山核桃外蒲壳中胡桃醌的提取工艺优化研究

沙如意1，2，3，申秀英1，2，3，蔡成岗1，2，3，毛建卫1，2，3

（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023；3.浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，浙江杭州310023）

摘要：采用单因素试验设计、正交试验设计法对山核桃外蒲壳中胡桃醌提取进行了优化，获得了料液比、提取温度、提取时间等参数，并建立了参数方程。由试验结果可知，采用超声波提取法、直接浸提粉末样品，甲醇提取率最高，考虑到安全问题选择乙醇为提取溶剂，提取溶剂乙醇效果好于甲醇和石油醚，且95%乙醇效果好于50%和70%乙醇，料液比以1∶40（g/mL）、提取时间和温度分别为50 min和40℃提取效果较佳。正交试验结果表明最佳工艺为B2A3C3，即料液比1∶40（g/mL），提取时间50min，提取温度50℃时，提取量为0.0625mg/mL，是非正交试验结果平均值的1.3倍。

山核桃（Juglans mandshurica Maxim）外果皮称为外蒲壳，未成熟时含有单宁和胡桃醌等成分，具有抑菌、抗肿瘤抗氧化和镇痛等作用我国传统中药用外蒲壳治疗胃病和皮肤病，有一定的疗效[1]。山核桃中起抑菌活性作用的主要为胡桃醌等物质。胡桃醌是从胡桃科植物中提取分离出来的一种萘醌类活性物质，具有抗菌、消炎、止血、镇痛、抑癌、抗氧化等多种生物活性，在抑菌活性方面具有较多的研究报道[2-7]，如吴朝霞[8]等研究了胡桃醌对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酵母菌、黑曲霉等的抑制作用，结果表明胡桃醌对这些微生物均有较好的抑制作用。目前关于山核桃外蒲壳中胡桃醌等抑菌活性物质的提取相关报道较少，为进一步加强对山核桃外蒲壳的高效利用，并加强对胡桃醌的性质研究，需要对胡桃醌进行提取工艺优化。本研究采用单因素和正交试验方法对胡桃醌提取工艺条件进行优化研究。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱、GZX-9023MBE电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；冷冻高速离心机：东旺仪器；HH-S26数显恒温水浴锅；RE-2000旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；KQ-500E型超声波清洗器：超声波提取提高KQ3200昆山市超声仪器有限公司；UV-5500PC紫外可见分光光度计（含比色皿）：上海元析仪器有限公司；PL202-S：梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；移液枪：Eppendorf中国有限公司；TG 15K离心机：长沙东旺实验仪器有限公司；XFB-400中药粉碎机：长沙中诚制药机械厂；100 mL容量瓶、100 mL烧杯、锥形瓶，60目筛、过滤漏斗等为材料：购自华东医药器材化剂公司。

1.2 主要试剂

1.2.1 山核桃外蒲壳

由临安当地果农提供，9月采摘后将外蒲壳于40℃烘干备用。将山核桃外蒲壳用中药粉碎机进行粉碎，后用60目筛过滤，得到棕黄色粉末。

胡桃醌（纯度99%）：sigma公司；甲醇、乙醇、石油醚等均为分析纯；配置胡桃醌标准品甲醇为色谱纯。

1.3 标准曲线绘制

1.3.1 标准溶液配制

称取2 mg胡桃醌标准品，置于50 mL容量瓶中，加入适量色谱纯甲醇，用35℃水浴促进胡桃醌溶解，并用甲醇定容，得胡桃醌标准溶液。

1.3.2 最大吸收波长确定

取标准溶液用分光光度计进行扫描，分别从400nm波长到450 nm波长，每隔5 nm和1 nm测定吸光度。

1.3.3 标准曲线制作

分别吸取胡桃醌标准溶液 0.05、0.25、0.、1.0、2.5、5.0、7.5 mL置于25 mL容量瓶中用甲醇定容，摇匀。以不加胡桃醌标准溶液容量瓶中用甲醇定容，摇匀。以不加胡桃醌标准溶液为空白对照。在426 nm处测定各溶液的吸光度。取标准溶液1.0 mL，按标准曲线制备的方法操作，用UV5500-PC紫外分光光度计测定。

1.4 方法

准确称取外蒲壳粉末4 g，于烧瓶中加入一定比例的提取溶剂，摇匀置于一定温度水浴锅中提取，提取液3 000 r/min离心10 min后，在60℃旋转蒸发仪蒸发浓缩溶液，再以甲醇定容至100 mL，在424 nm波长下分别测吸光度，计算得率。提取溶剂、提取温度和提取时间根据试验设计进行选择。

1.4.2.1 单因素试验

以100 mL酒精（95%）于30℃水浴锅和超声波提取器中分别提取30 min，离心浓缩后测定提取率。

2）提取溶剂的确定

分别向外蒲壳粉末中加入30mL甲醇，乙醇（95%）和石油醚，30℃超声20 min，离心后上清液旋转蒸发得浸膏，再以甲醇定容至25 mL容量瓶中，测定胡桃醌提取率。

3）乙醇浓度确定

以质量分数为50%、70%、95%的乙醇对外蒲壳进行超声提取，试验方法同1.4.1。

4）料液比的选择

分别设置山核桃外蒲壳与95%乙醇溶液的料液比例为 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），进行超声提取，确定料液比对提取效果的影响。

5）超声提取时间

选择 20、30、40、50、60、90 min 进行超声提取，确定提取时间对提取效果的影响。

采用超声辅助提取法，分别测定 20、30、40、50、60℃下不同温度对胡桃醌提取率的影响。

1.4.2.2 正交试验设计

依据单因素试验的结果，对提取时间（A）、液料比（B）、温度（C）三因素进行考察，按L9（34）正交表进行实验，以胡桃醌提取率即最终提取液的吸光度作为考察指标，探讨最佳提取工艺条件。正交试验设计因素水平见表1。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

采用紫外可见分光光度计扫描，从410 nm波长到430 nm波长每隔1 nm测吸光度，获得胡桃醌吸收光谱图，如图1所示。

如图1所示，在424 nm处取得最大吸光度，所以取424 nm为检测波长。

2.2 胡桃醌标准曲线

以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线图（图 2），标准回归曲线方程：y＝0.083 3x+0.048 7，R2＝0.979，说明胡桃醌在0～25 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 水浴、超声提取结果

两种方法提取胡桃醌含量如表2所示。

超声法可以提高胡桃醌提取量，可能与超声波可作用于分子内部，增大样品与萃取溶剂之间的接触面积，提高目标物从固相转移到液相的传质速率相关。

2.3.2 提取溶剂选择

以甲醇、乙醇和石油醚为提取溶剂，结果如表3所示，甲醇效果最好，但考虑到实践应用中的安全性等问题，选取95%乙醇作为提取溶剂。

2.3.3 乙醇浓度确定

综合比较50%，70%，95%的乙醇对胡桃醌提取的影响，结果如表4所示，随着乙醇浓度的上升，提取胡桃醌的效果越好。因此95%的乙醇作为提取溶剂。

2.3.4 料液比的选择

试验结果如表5所示，随着料液比的增大，提取液中胡桃醌含量呈现增加趋势，在1∶40（g/mL）时效果最好，因此 1 ∶40（g/mL）为较适料液比。

2.3.5 超声提取时间

分别提取 20、30、40、50、60、90 min，结果如表 6所示。

超声提取时间在60 min内可以促进胡桃醌提取效果，但90 min时略有下降，可能因不稳定性等原因所致，另外50 min后即可达到较佳的提取效果，因此选择50 min为提取时间。

2.3.6 温度的选择

分别测定 20、30、40、50、60 ℃提取温度对胡桃醌提取率的影响。结果如表7所示，结果表明，提取温度40℃最为合适。

2.4 正交试验结果

根据单因素试验结果设计的正交试验结果见表8。

各试验因子因素水平图如图3所示。

由图3可知，因素A以3水平提取效果最好，因素B以2水平提取效果最好，因素C以第三水平效果较好。

正交试验结果分析显示，影响山核桃蒲外壳中胡桃醌量的主次因素为B＞A＞C，即溶剂用量＞提取时间＞提取温度。最佳工艺为B2A3C3，即料液比为1∶40（g/mL），提取时间 50 min，提取温度 50℃。

在对已经优化的条件进行验证后发现，优化的试验条件下可以得到较好的试验水平。结果表明，胡桃醌的提取量达到较佳的提取效果，3次提取结果分别为 0.062 8、0.062 2、0.062 5 mg/mL，是非正交试验结果平均值的0.048 mg/mL的1.3倍。

3 总结

采用单因素试验设计和正交试验设计方法对山核桃外蒲壳中胡桃醌提取进行了优化，结果表明，超声波提取法效果好于直接浸提，甲醇提取率最高，考虑到安全问题选择乙醇为提取溶剂，石油醚最差，95%的乙醇提取效果好于50%和70%的乙醇，料液比以1∶40（g/mL）为最好，较佳的提取时间和温度分别为50 min和40℃。正交试验结果表明，正交试验最佳工艺为B2A3C3，即料液比 1 ∶40（g/mL），提取时间 50 min，提取温度50℃。提取效果提高到0.062 5 mg/mL，是非正交实验结果平均值0.048 mg/mL的1.3倍。相关的优化研究还需进一步深入。

[1] 申秀英,毛建卫,蔡成岗.山核桃外蒲壳成分与功能研究进展[J]．食品研究与开发,2013,34(21)：128-130

[2] 许绍惠,许泓．胡桃属植物毒性成分及其应用[J]．沈阳农业大学学报,1990,21(2)：167-170

[3] 马良进,林君阳,李桥,等．山核桃外果皮中的抑菌活性成分[J]．林业科学,2009,45(12)：90-94

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[5] 张昕,张立钦,马良进,等．山核桃果皮提取液的抑菌活性研究[J]．安徽农业科学,2010,38(4)：2034-2036

[6] 孙广仁,姚大地,由士江．山核桃青果皮对几种人类致病细菌的抑制作用[J]．东北林业大学学报,2009,37(1)：92-93

[7] 刘丹萍,张立钦,陈安良,等．山核桃外果皮中胡桃醌含量测定及抑菌活性[J]．农药,2010,49(9)：686-701

[8] 吴朝霞,陈光启,王媛.胡桃醌对几种常见食品腐败微生物的抑制作用[J]．中国酿造,2009,209(8)：76-78

SHA Ru-yi1，2，3，SHEN Xiu-ying1，2，3，CAI Cheng-gang1，2，3，MAO Jian-wei1，2，3
（1.School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.Key Laboratory of Agricultural Products Chemical and Biological Processing Technology of Zhejiang Province，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources，Hangzhou 310023，Zhejiang，China）

Abstract：Thesinglefactorandorthogonalexperimentdesignmethodswereutilizedtooptimizetheextractioncon ditions of juglone from Hickory Hull.The results showed that the ultrasonic extraction method，methanol as extraction reagent had higher extraction rate，but for safety consideration，ethanol was better than methanol and petroleumether，and95%ethanolisbetterthan50%and70%ethanol，the material liquid ratio of 1 ∶40（g/mL），extraction time and temperature of 50 min and 40℃ showed higher extraction rate.Orthogonal experiment results showed that the optimal conditions of B2A3C3，namely the material liquid ratio of 1 ∶40（g/mL），extraction time and temperature of 50 min and 50℃had the optimal extraction rate of 0.062 5 mg/mL，which was 1.3 times than the average value of single factor experiments.

基金项目：杭州科技发展计划项目（20120433B06）；浙江省教育厅科研项目（Y201327551）

作者简介：沙如意（1982—），男（汉），讲师，博士，研究方向：发酵与生物资源利用。