表1 响应面试验分析因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experient
因素 代码 水平-1 0 1乙醇体积分数/% X1 40 55 70超声温度/℃ X2 60 70 80提取时间/min X3 20 30 40
摘 要：为确定豆腐柴多酚的最佳提取工艺条件，在单因素试验基础上，采用三因素三水平的响应面试验优化设计方法，研究乙醇体积分数、超声温度、提取时间对多酚提取率的影响，得到最佳提取工艺条件为液料比40 mL/g、乙醇体积分数52%、超声温度74℃、提取时间33min，在此条件下豆腐柴多酚提取率为（42.43±1.38）mg/g。
关键词：豆腐柴；多酚；响应面法；超声；提取
豆腐柴（Premna microphylla Turcz）又名腐婢、观音草，为马鞭草科豆腐柴属多年生落叶灌木[1]，在中国有悠久的食用和药用历史，是一种重要的植物资源。现代研究证明，豆腐柴叶具有高蛋白、低脂肪、富含果胶、膳食纤维的特性[2-3]，且富含维生素C、β胡萝卜素、过氧化物酶、黄酮等化学成分及微量元素等[4-5]。据文献报道，豆腐柴具有增肌、增强免疫、抗疲劳、抗炎、抗菌、抗氧化等作用[6-8]。
植物多酚在自然界广泛存在植物的皮、叶、根、果中，其在抗氧化、抗炎、抗辐射、预防心脑血管疾病等方面具有重要的生理活性作用，可广泛应用于食品和医药领域[9-10]。本研究首次将超声波技术和Design-8.0.6软件应用于豆腐柴多酚的提取，为豆腐柴的综合开发利用提供一定参考。
豆腐柴：采摘自浙江省浦江县仙华山，经水洗、干燥、粉碎、过100目筛，密封储存于阴凉干燥处；没食子酸标准品：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、钨酸钠、钼酸钠、碳酸钠、过氧化氢、磷酸、硫酸等均为分析纯。
Spectrumlab755s紫外可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；BS224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；BL3-120C超声清洗器：上海比朗仪器有限公司；GT10-2台式高速离心机：北京时代北利离心机有限公司。
精确称量0.2 g豆腐柴于大试管中，加入一定量的提取溶剂，放入功率200 W，频率59 Hz的超声波清洗器中，在不同条件下超声辅助提取多酚。提取后，3 000 r/min离心取上清液，用蒸馏水定容至25 mL。首先，对液料比（10、20、40、60、80、100 mL/g），乙醇体积分数（20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%），超声温度（40、50、60、70、80 ℃），提取时间（10、20、30、40、50 min）进行单因素考察。在单因素试验基础上，固定液料比40 mL/g，以乙醇体积分数、提取时间、提取温度为考察因素，采用Design Expert软件的Box-Behnken模型响应面方法进行三因素三水平优化试验，因素水平见表1。
表1 响应面试验分析因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experient
因素 代码 水平-1 0 1乙醇体积分数/% X1 40 55 70超声温度/℃ X2 60 70 80提取时间/min X3 20 30 40
采用福林酚比比色法测定[11]。精密称量5 mg没食子酸标准品，用水定容至50 mL，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于 25 mL 容量瓶中，加入15 mL蒸馏水，加入1.5 mL稀释一倍的福林酚试剂，静置5 min，加入4 mL 20%的碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至25 mL，40℃室温避光40 min后，于755 nm测其吸光度，得到没食子酸质量浓度ρ（mg/mL）与吸光度A的回归方程为 ρ=4.510 4A+0.026 3（R2=0.997 0）。用同样方法测定待测定豆腐柴多酚提取液的吸光度值。
式中：M为每g豆腐柴中多酚的含量，mg；C为根据标准曲线计算出的待测液的多酚含量，mg；V为待测液体积，mL；m为豆腐柴的质量，g；N为豆腐柴多酚提取液的体积，mL。
单因素试验结果与分析见图1。
由图1（a）可知，固定其它因素（乙醇体积分数70%、超声温度60℃、提取时间20 min），豆腐柴多酚提取率随液料比增大而提高，但从40 mL/g后提取率增长趋势缓慢，说明多酚的溶出量已较完全，从节约容积角度考虑，将液料比固定为40 mL/g。
图1 不同提取条件对多酚提取率的影响
Fig.1 Effect of different factors on the yield of polyphenol
由图1（b）可知，固定其它因素（超声温度60℃、提取时间20 min、液料比40 mL/g）乙醇体积分数在20%～50%时，多酚提取率随乙醇体积分数的增加而增加，在50%～80%呈降低趋势，因此将乙醇体积分数的考察范围定为40%～70%。
由图1（c）可知，固定其它因素（液料比40 mL/g、乙醇体积分数70%、提取时间20 min），随温度的升高，豆腐柴多酚提取率逐渐增大，但60℃后，多酚提取率增加较小，因此，将超声温度的考察范围定为60℃～80℃。
由图1（d）可知，固定其它因素（液料比40 mL/g、乙醇体积分数70%、超声温度60℃），随提取时间的增加，豆腐柴多酚提取率先增大后减小，在20 min～40 min提取率最大，因此将提取时间的考察范围定为20 min～40 min。
利用Design-Expert 8.0.6软件对豆腐柴多酚提取率显著影响因素进行响应面分析，Box-Behnken试验设计及结果见表2，得到总多酚（Y）对乙醇体积分数（X1）、超声温度（X2）、提取时间（X3）的多元二次回归模型方程式：
表2 试验设计及结果
Table 2 Experiment design and test results
试验号X1X2X3Y多酚提取率/（mg/g）1 -1 0 1 37.65 2 0 -1 1 34.90 3 0 1 -1 36.77 4 -1 0 -1 33.15 5 -1 1 0 37.79 6 1 -1 0 32.48 7 1 0 -1 30.42 8 0 1 1 39.24 9 0 -1 -1 33.73 10 1 0 1 32.65 11 -1 -1 0 32.10 12 1 1 0 32.18 13 0 0 0 41.03 14 0 0 0 42.01 15 0 0 0 42.50 16 0 0 0 39.88 17 0 0 0 41.70
利用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行响应面分析，得出回归模型的方差分析见表3。
表3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance
注：** 影响极显著，P＜0.01；* 影响显著，P＜0.05；N 影响不显著，P＞0.05。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 256.75 9 28.53 30.32 ＜0.000 1 **X1 21.00 1 21.00 22.31 0.002 1 **X2 20.38 1 20.38 21.66 0.002 3 **X3 13.44 1 13.44 14.29 0.006 9 **X1X2 8.97 1 8.97 9.53 0.017 6 *X1X3 1.29 1 1.29 1.37 0.280 3 N X2X3 0.42 1 0.42 0.45 0.524 3 N X12 115.59 1 115.59 122.85 ＜0.000 1 **X22 27.31 1 27.31 29.03 0.001 0 **X32 31.08 1 31.08 33.03 0.000 7 **残差 6.59 7 0.94失拟项 2.47 3 0.82 0.80 0.555 1 N纯误差 4.12 4 0.01总离差 263.33 16
由表可知，模型的P＜0.01，表明模型高度显著；失拟项P＝0.555 1＞0.05，表明差异不显著，说明残差是由随机误差引起，各因素中一次项（X1、X2、X3）和二次项（X12、X22、X32）的 P 值均小于 0.01，说明其对结果影响不显著，交互项X1X2＜0.05，可能是因为温度高而因其乙醇挥发造成体积减小引起的。
超声温度和乙醇体积分数的交互作用响应曲面见图2，提取时间和乙醇体积分数的交互作用相应曲面见图3，提取时间和超声温度的交互作用相应曲面见图4。
图2 超声温度和乙醇体积分数的交互作用响应曲面
Fig.2 Response surface for the effect of ultrasonic temperature and ethanol concentration
图3 提取时间和乙醇体积分数的交互作用相应曲面
Fig.3 Response surface for the effect of extraction time and ethanol concentration
图4 提取时间和超声温度的交互作用相应曲面
Fig.4 Response surface for the effect of extraction time and ultrasonic temperature
由图2、图3、图4中各因素对响应面的变化情况可知，豆腐柴多酚提取率Y值均随着超声温度、乙醇体积分数、提取时间的变化表现为开口向下的抛物线，说明响应面设计的考察范围选取得当，包含了3个因素的最佳水平。同时可以看出，乙醇体积分数对多酚提取率的影响最大，超声温度和提取时间次之。
由Design-Expert8.0.6软件分析得，最佳提取条件为乙醇体积分数51.6%、超声温度73.99℃、提取时间32.86min，此条件下理论多酚提取率达42.11mg/g。考虑到试剂操作方便，将各因素改为乙醇体积分数52%、超声温度74℃、提取时间33 min，在修正条件下进行3 次试验，豆腐柴多酚的提取率为（42.43±1.38）mg/g，与理论预测值相对比误差为0.76%。该值与预测值基本吻合，证实采用响应面优化得到的提取条件准确可靠，具有实用价值。
响应面优化超声辅助提取豆腐柴多酚的最佳工艺件为：液料比40 mL/g、乙醇体积分数52%、超声温度74℃、提取时间33 min。在此条件下，多酚提取率为（42.43±1.38）mg/g。结果表明，建立的回归模型模拟良好，理论值和预测值基本一致。
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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Total Polyphenol from Premna microphylla Turcz by Response Surface Methodology
Abstract：In order to achieve the optimum extraction conditions of total polyphenol from Premna microphylla Turcz by response surface methodology.On the basis of single factor tests，the response surface of three factorsand three levels test optimization design method was used to study ethanol concentration，ultrasonic temperature，extraction time these factors'impact on polyphenol yield.The optimum extraction conditions were：liquid to material ratio 40 mL/g，ethanol concentration 52%，ultrasonic temperature 74℃，extraction time 33 min.Under these conditions，the yield of extracted polyphenol could be up to（42.43±1.38）mg/g.
Key words：Premna microphylla Turcz；polyphenol；response surface methodology；ultrasonic；extraction
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.016
收稿日期：2016-03-23