图1 花青素标准曲线
Fig.1 Standard curve of anthocyanins
摘 要：通过单因素试验和正交试验对影响蓝莓花青素提取量的因素进行研究。结果表明，在酸性条件下，乙醇浓度60%、料液比1∶10（g/mL）、提取温度50℃、提取时间90 min为蓝莓花青素最佳提取工艺条件，提取量达343.30 mg/100g。
关键词：蓝莓；花青素；提取；含量分析
花青素（anthocyanin）是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，具有类黄酮的典型结构[1-3]，是一种天然抗氧化剂，具有抗衰老、清除自由基、抗炎、调节血脂、抗癌、改善视力等多种功能[4-6]。由于蓝莓中所含花青素是所有果蔬中最高的[7]，且具有低糖、低脂肪的特性，被称为继苹果和柑橘之后的“世界第三代水果”[8]，国际粮农组织将其列为人类5大健康食品之一。近年来，人们逐渐认识到蓝莓的营养价值和保健功能，消费市场不断扩大。对蓝莓花青素进行提取并将其应用到医疗保健、功能性食品工业，可以促进蓝莓产业的发展，具有广阔的前景和重要的意义。
目前花青素常用的提取方法有：溶剂提取法、超临界萃取法、微波辅助提取法、酶提取法和超声辅助提取法[9]。本文通过单因素和正交试验对蓝莓花青素的溶剂提取进行了系统的研究，分别考察溶剂类型、提取温度、料液比、溶剂浓度、pH值、提取时间对蓝莓花青素提取量的影响，为充分利用蓝莓花青素和综合利用蓝莓资源提供参考。
蓝莓：购自山东青州弥河镇，挑选颜色一致、颗粒饱满的果实置于冰箱中冻藏。
芦丁：中国医药集团上海化学试剂公司；氢氧化钠、乙醇、亚硝酸钠等均为分析纯。
JA2003型电子精密天平：上海良平仪器仪表有限公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；数显式电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；800型离心沉淀器：上海手术器械厂。
1.2.1 蓝莓花青素的提取
蓝莓200 g，打成匀浆，备用。取适量蓝莓果浆进行溶剂提取，离心分离提取液，取上清液，于510 nm处测定其吸光度值，与标准曲线进行比较定量。
1.2.2 花青素标准曲线的绘制
参照张莉弘等[10]标准曲线的绘制方法，准确称取芦丁标准品0.500 0 g于小烧杯中，用少量无水乙醇溶解，转移并用蒸馏水定容至1 000 mL。准确吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL标准溶液于10mL 具塞比色管中，分别加入0.4 mL NaNO2溶液（50 g/L）、0.4 mL Al（NO3）3溶液（100 g/L），摇匀、静置 5 min～10 min，再加 4 mL NaOH溶液（100 g/L），摇匀并加水至刻度线，静置15 min，于510 nm处测吸光度，并做试剂空白测定。
1.2.3 蓝莓花青素提取单因素试验
1.2.3.1 提取剂浓度对花青素提取量的影响
本试验采用提取效果好的酸性乙醇为提取剂，称取5份1.0 g蓝莓果浆（精确至0.000 1 g），分别用10 mL 40%、50%、60%、70%、80%酸性乙醇于50℃下提取1 h，将提取液离心，取上层清液1 mL于10 mL具塞比色管中，按照标准曲线测定方法测其吸光度值。
1.2.3.2 料液比对花青素提取量的影响
称取5份蓝莓果浆（精确至0.000 1 g），分别用10 mL酸性乙醇溶液（60%）配制成 1∶6、1∶8、1∶10、1 ∶12、1 ∶14（g/mL），于 50 ℃下提取 1 h，将提取液离心，取上层清液测其吸光度值。
1.2.3.3 提取温度对花青素提取量的影响
称取5份1.0 g蓝莓果浆（精确至0.000 1 g），分别用 10 mL 酸性乙醇溶液（60%）于 30、40、50、60、70 ℃的水浴中提取1 h，将提取液离心，取上层清液测其吸光度值。
1.2.3.4 提取时间对花青素提取量的影响
称取5份1.0 g蓝莓果浆（精确至0.000 1 g），分别用10 mL酸性乙醇溶液（60%）于50℃水浴中提取30、60、90、120、240 min，将提取液离心，取上层清液测其吸光度值。
1.2.3.5 pH值对花青素提取量的影响
称取5份1.0 g蓝莓果浆（精确至0.000 1 g），分别用 pH 为 2、3、4、5、6的 10 mL 酸性乙醇溶液（60%）于50℃水浴中提取1 h，将提取液离心，取上层清液测其吸光度值。
1.2.4 蓝莓花青素提取正交试验
结合单因素试验结果，以提取剂浓度、料液比、提取时间、提取温度为影响因素，分别选取3个水平进行正交试验，以花青素提取量为考察指标，确定花青素提取的最佳工艺条件。
以吸光度为纵坐标，花青素浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1所示。
2.2.1 提取剂浓度对花青素提取量的影响
提取剂浓度对花青素提取量的影响见图2。
图1 花青素标准曲线
Fig.1 Standard curve of anthocyanins
图2 提取剂浓度对花青素提取量的影响
Fig.2 Effect of extraction solvent concentration on yield of anthocyanins
由图2可看出，蓝莓花青素的提取量随着提取剂浓度的升高呈现出先上升后下降的趋势，乙醇浓度60%时，花青素的提取量最大，这是由于乙醇浓度较低时，糖、果胶和其它水溶性色素的溶解影响了花青素的溶出[11]；乙醇浓度过高时会破坏花青素结构[12]，亦或是脂溶性物质易溶出导致花青素的提取量下降[13]。
2.2.2 料液比对花青素提取量的影响
料液比对花青素提取量的影响见图3。
图3 料液比对花青素提取量的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on yield of anthocyanins
由图3可看出，蓝莓花青素的提取量随着提取剂用量的增大呈现出先上升后略微下降的趋势，这是由于提取剂用量增大，使得蓝莓果浆与溶剂接触面积增大，易于花青素的溶出；提取剂用量过高不仅造成其他杂质的大量溶出，使花青素的提取量降低，又会增加成本。
2.2.3 提取温度对花青素提取量的影响
提取温度对花青素提取量的影响见图4。
图4 提取温度对花青素提取量的影响
Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of anthocyanins
由图4可看出，蓝莓花青素的提取量随着提取温度的升高呈现出先急剧增加后略有下降的趋势，这是由于蓝莓花青素在温度较低时稳定，在50℃时提取量最大，继续升温会造成花青素的降解。
2.2.4 提取时间对花青素提取量的影响
提取时间对花青素提取量的影响见图5。
图5 提取时间对花青素提取量的影响
Fig.5 Effect of extraction time on yield of anthocyanins
由图5可看出，蓝莓花青素的提取量随着提取时间的增加呈现出先急剧增加后缓慢增加的趋势，这是因为提取液中花青素含量不断增大，影响了其继续溶出，且在较高温度下长时间加热也会导致花青素结构发生变化。
2.2.5 pH值对花青素提取量的影响
pH值对花青素提取量的影响见图6。
图6 pH值对花青素提取量的影响
Fig.6 Effect of pH value on yield of anthocyanins
由图6可看出，蓝莓花青素的提取量随着pH值的增大呈现下降的趋势，pH值为4时花青素提取量最低，这是因为随着pH值的增大，花青素不稳定，结构发生变化。
在单因素试验的基础上，选择提取剂浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）为研究对象，在pH值为2时，采用四因素三水平正交试验研究蓝莓花青素在不同条件下的提取量。对因素A、B、C、D在试验范围内分别取3个水平：A=50%、60%、70%，B=1∶8、1 ∶10、1 ∶12 g/mL，C=40、50、60 ℃，D=60、90、120 min，正交试验结果见表1。
表1 正交试验结果
Table 1 Results of the orthogonal test
试验号 因素 花青素提取量/（mg/100 g）A B C D 1 1 1 1 1 286.54 2 1 2 2 2 333.84 3 1 3 3 3 296.00 4 2 1 2 3 314.92 5 2 2 3 1 305.46 6 2 3 1 2 314.92 7 3 1 3 2 305.46 8 3 2 1 3 296.00 9 3 3 2 1 314.92 k1 305.46 302.31 299.15 302.31 k2 311.77 311.77 321.23 318.07 k3 305.46 308.61 302.31 302.31 R 6.31 9.46 22.07 15.77主次顺序 C>D>B>A优水平 A2B2C2D2
由表1可见，影响花青素提取量因素的主次顺序为：提取温度>提取时间>料液比>提取剂浓度，蓝莓花青素提取的最优条件是A2B2C2D2，即乙醇浓度 60%、料液比 1∶10（g/mL）、提取温度 50℃、提取时间90 min。经验证，此条件下，蓝莓花青素的提取量达343.30 mg/100 g。
在蓝莓花青素的提取中，提取温度对提取量影响最大，这是由于花青素是蓝莓中多酚的重要组成部分，是一种天然抗氧化剂，但其自身容易被氧化，温度较高时，花青素易发生氧化；温度较低时，花青素与蛋白质、纤维素等化合物分离较慢。作为一种天然多酚类化合物，蓝莓花青素是小分子、水溶性物质，提取时间太长，会导致花青素的氧化增加，多糖、蛋白质等大分子的溶出增多，花青素提取量降低。此外，提取剂用量及浓度对蓝莓花青素的提取量也有影响，除考虑提取成本外，还因为提取剂的用量及浓度会影响糖、果胶和其它水溶性色素或脂溶性物质的溶出。
本研究采用酸性乙醇在不同条件下对蓝莓中花青素进行提取，结果表明，影响蓝莓花青素提取量的最主要因素是提取温度，其次是提取时间，当提取条件为：乙醇浓度 60%、料液比 1 ∶10（g/mL）、提取温度50℃、提取时间90 min，可达到最佳提取效果，提取量达到343.30 mg/100 g。
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Extraction and Content Analysis of Blueberry Anthocyanin
Abstract：The effects on extraction yield of anthocyanins were studied by single factor experiment and orthogonal experiment.The results showed that the optimal conditions were as follows：alcohol concentration 60%，solid-liquid ratio 1∶10（g/mL），extraction temperature 50℃，extraction time 90 min.Under these conditions，blueberry anthocyanin yield was up to 343.30 mg/100 g.
Key words：blueberry；anthocyanin；extraction；content analysis
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.015
收稿日期：2015-07-06