表1 响应面试验设计因素和水平
Table 1 Factors and levels of box-benhnken design test
水平D提取时间/min-1 30 70 70 60 0 40 80 80 120 1 50 90 90 180因素A液料比/（mL/g）B乙醇体积分数/%C提取温度/℃
摘 要：以乙醇为提取溶剂，采用单因素和响应面分析法相结合的手段优选芹菜中黄酮提取工艺。首先通过单因素试验初步探讨了液料比、乙醇浓度、提取温度和提取时间4个主要因素对黄酮得率的影响规律。然后，采用Box-Behnken中心组合设计试验，建立了回归方程的预测模型，方差和响应面分析结果表明：4个因素及其二次项对黄酮提取率影响显著，料液比和提取温度、料液比和提取时间、乙醇体积分数和提取温度之间的交互作用显著。最终，确定了芹菜黄酮提取的最佳工艺条件为液料比41∶1（mL/g），乙醇体积分数84%，提取温度83℃，提取时间134 min，在此条件下黄酮提取率为3.276%。
关键词：芹菜；黄酮；响应面法；工艺优化
芹菜（Apium graveolens L.）种属为伞形花科类，不仅营养丰富作为餐桌的佳肴，且研究证实其中含有多种黄酮类化合物，在医学上对高血压的治疗起到很大的帮助作用。由于作为食材时主要选用芹菜的嫩茎叶，其他部分则浪费较多，大量上市时价格低廉也影响菜农收益，因此，加强芹菜副产品的开发利用具有一定的保健价值和实际意义。
关于芹菜黄酮的研究已有相关文献报导，如王克勤[1-3]等对湖南地区芹菜的不同品种以及不同部位的黄酮提取量进行了系统研究，采用正交法优化提取工艺，并提取物进行了定量分析；赵云玲[4]采用正交试验法优化了芹菜黄酮的提取工艺，Baiano[5]等研究了微波辅助和传统方法提取蔬菜固体废物中抗氧化剂工艺变量的单一和交互影响过程，Profir[6]等研究了甜菜根、胡萝卜和芹菜混合汁经冷藏后的抗氧化性演变规律，可见对芹菜中黄酮类化合物的研究主要集中在黄酮含量的分析、抗氧化能力和药理学功能等方面，对芹菜黄酮提取工艺多采用正交试验法进行优化，而采用响应面优化芹菜黄酮的研究报道相对较少。
本文在借鉴现有研究成果的基础上，对徐州当地的芹菜叶中黄酮化合物进行乙醇提取试验，并采用响应面法对提取工艺条件进行优化，通过紫外-可见分光光度计测定提取液中黄酮含量，为促进徐州本地芹菜的开发利用提供参考。
1.1.1 主要仪器设备
T6新世纪紫外-可见分光光度计（含配套1 cm比色皿）：北京普析通用仪器有限责任公司；HH.S21-4-B型电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；101-1AB型电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；FA1004电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵：山东荷泽市祥龙电子科技有限公司。
1.1.2 主要试剂和样品
芦丁标准品：Aladdin Industrial Corporation；无水乙醇（AR）：国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠（AR）：中国徐州试剂总厂；氢氧化钠（AR）：天津市光复科技发展有限公司；硝酸铝（AR）：天津市福晨化学试剂厂；芹菜：购于徐州当地农贸市场。
1.2.1 黄酮的提取与含量测定
本研究采用乙醇加热浸提法作为芹菜中黄酮提取的基本工艺，通过紫外-可见分光光度计测定提取液中黄酮类化合物含量。试验时先将芹菜清洗干净，晾干粉碎，置于烘箱中，65℃干燥约8 h至烘干，研成粉末，过50目筛，放于广口瓶中备用。准确称取2.00 g芹菜粉末置于三口烧瓶中，控制一定温度，加入乙醇溶液进行提取，一定时间后趁热抽滤，将提取液用无水乙醇定容至100 mL容量瓶中，待测。测定时移取溶液2 mL于25 mL容量瓶中，滴加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后静置6 min，然后滴加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后静置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液10 mL，定容至刻度，摇匀静置15 min后，于510 nm波长处测定吸光度。
1.2.2 标准曲线的绘制
提取液中黄酮含量以芦丁计，按照标准曲线法进行测定。首先精密称取10 mg芦丁标准品溶于50 mL容量瓶中配制成0.2 mg/mL的标准储备液。然后分别移取 0、2.5、5、7.5、10、12.5 mL 于 25 mL 容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后静置6 min，10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后静置6 min，4%氢氧化钠溶液10 mL，用乙醇定容至刻度，摇匀静置15 min。配制成 0.00、.0.02、0.04 、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的芦丁标准液，于510 nm波长处测定吸光度。以吸光度值（A）对浓度（c）绘制标准曲线，经最小二乘法得到标准曲线方程：A＝7.775 0c+0.017 6，R2＝0.994 5。说明在 0～0.1 mg/mL范围内，吸光度和芦丁浓度呈良好的线性关系。
1.2.3 单因素试验
选择液料比（A）、乙醇体积分数（B）、提取温度（C）和提取时间（D）对黄酮化合物提取率影响较大的4个因素，分别进行单因素试验，确定各因素适宜的水平。
1.2.4 黄酮提取工艺参数的优化
在单因素试验基础上，以黄酮提取率为响应值，采用响应面法进行优化，试验因素和水平见表1。
表1 响应面试验设计因素和水平
Table 1 Factors and levels of box-benhnken design test
水平D提取时间/min-1 30 70 70 60 0 40 80 80 120 1 50 90 90 180因素A液料比/（mL/g）B乙醇体积分数/%C提取温度/℃
2.1.1 液料比对黄酮提取率的影响
准确称取2.00 g干芹菜粉末，使用60%乙醇分别以 20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）的液料比在80℃的温度下提取，120 min之后进行过滤，测定吸光度，根据吸光度计算黄酮的得率，结果见图1。
图1 液料比对黄酮提取率的影响
Fig.1 Effects of ratio of liguid to material on yield of flavonoids
在有机溶剂的提取试验中，本试验中首先要选择合适的液料比，这样有助于原料之间充分完全反映又不会影响产物的生成，达到预期的得率。在该试验中，溶剂的量越大，越有助于黄酮类化合物的溶解，使反应正向性增强。图1的曲线反映的是黄酮提取率随液料比升高的变化趋势。液料比从20∶1（mL/g）变化到40 ∶1（mL/g），提取率也越来越高，30 ∶1（mL/g）到 35∶1（mL/g）之间液料比增加，提取率提升的最为迅速。液料比超过40∶1（mL/g），提取率反而略有下降，这说明这时加入溶剂不但对提取率的提高没有帮助，也造成了资源的浪费。
2.1.2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响
准确称取2.00 g干芹菜粉末，分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇在80℃的温度下以液料比为 40 ∶1（mL/g）提取 120 min，测定吸光度，根据吸光度来计算黄酮的得率，结果见图2。
图2 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
Fig.2 Effects of ethanol concentration on yield of flavonoids
如图2，乙醇浓度会影响芹菜中黄酮的提取率，从折线图可以看出乙醇浓度为80%时提取效果相对较好。再增加乙醇的浓度，黄酮的提取率反而有所下降。芹菜中黄酮化合物的基本上分为两类，一种是能够与水、乙醇、甲醇极性溶剂互溶的，称黄酮苷，另一类是只与有机溶剂相溶的，称黄酮苷元。在提取粗黄酮溶液时会出现不同含量的黄酮苷元和黄酮苷，这种现象主要是由乙醇的浓度造成的，乙醇的浓度在试验中要严格控制。
2.1.3 提取温度对黄酮提取率的影响
准确称取2.00 g干芹菜粉末，用70%乙醇分别在40、50、60、70、80、90 ℃下，以液料比为 40 ∶1（mL/g）提取120 min，测定吸光度，计算黄酮得率，结果见图3。
图3表明，从整体上看，温度升高，黄酮的提取率也越来越高；但温度从80℃升高到90℃时，提取率反而出现了下降的趋势。可能是因为开始的时候升高温度，会使物质进一步溶解，分子运动剧烈程度增加，更利于渗透的进行。因此芹菜中黄酮提取率整体呈上升趋势。但随着温度再升高，过高的温度反而会破坏黄酮类化合物的活性分子。因此从试验得出在80℃是黄酮提取的最佳温度。
图3 提取温度对黄酮提取率的影响
Fig.3 Effects of extraction temperature on yield of flavonoids
2.1.4 提取时间对黄酮提取率的影响
准确取2.00 g干芹菜粉末，温度设置为70℃，控制液料比为40∶1（mL/g），在70%的乙醇下回流提取30、60、90、120、150、180 min 后，测定吸光度，计算黄酮得率，结果见图4。
图4 提取时间对黄酮提取率的影响
Fig.4 Effects of extraction time on yield of flavonoids
可以用扩散、渗透和溶解来描述芹菜黄酮类化合物的提取。通常，提取的充分度与提取时间成正比，但是，当反应中的反应物之间达到了一种平衡了，再加入物质来破坏其平衡，不利于最后的得率，杂质也将变多。此外，长时间处于高温条件下芹菜黄酮类物质不稳定，会氧化分解，反而使得得率有所下降。从试验结果可以看出，当提取时间为120 min时，黄酮已经很好的被提取出来。再增加时间，反而会使这种平衡会打破，黄酮类物质反含量反而降低。时间过长还可能使黄酮的内部结构遭到破坏，得率会因此而下降。
2.2.1 响应面设计及结果
根据响应面分析法中的Box-Behnken中心组合设计原理，以芹菜中黄酮提取率为响应值，取液料比（A）、乙醇浓度（B）、提取温度（C）、提取时间（D）设计四因素三水平的响应面分析试验。响应面试验设计及结果见表2。
表2 响应面试验设计与结果
Table 2 Box-Behnken design matrix and the response values
试验号 A B C D 黄酮提取率/%1 0 1 1 0 2.827 2 0 -1 0 -1 1.399 3 -1 0 0 0 1.849 4 0 -1 -1 0 1.587 5 0 1 0 -1 2.170 6 0 1 0 1 2.783 7 0 0 0 1 1.973 8 -1 0 0 1 2.349 9 0 0 0 0 3.182 10 1 0 -1 0 1.632 11 0 1 -1 0 2.107 12 -1 1 0 0 2.157 13 0 -1 0 1 1.597 14 -1 -1 0 0 1.270 15 0 0 0 0 3.050 16 -1 0 0 -1 1.711 17 0 0 1 1 2.545 18 0 0 0 0 3.131 19 0 -1 -1 0 1.510 20 0 0 0 0 3.108 21 1 0 0 1 2.051 22 0 0 0 0 3.149 23 1 1 0 0 2.431 24 -1 0 -1 0 1.555 25 0 0 1 -1 2.134 26 0 0 -1 -1 1.834 27 1 0 0 -1 2.006 28 1 -1 0 0 1.375 29 1 0 1 0 2.551
2.2.2 模型的建立及其显著性检验
采用Design-Expert软件对试验结果进行响应面回归分析，得到芹菜中黄酮提取率对所选四个因素（即液料比、乙醇浓度、提取温度、提取时间）的二次多项回归方程为：
芹菜黄酮提取率/%=3.12+0.096×A+0.48×B+0.24×C+0.17×D+0.042×A×B+0.16×A×C-0.15×A×D+0.16×B×C+0.10×B×D+0.068×C×D-0.67×A2-0.64×B2-0.52×C2-0.47×D2
对所得模型进行显著性检验，结果如表3所示；回归方程系数及其显著性检验见表3。
表3 多元回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the response surface quadratic model
注：模型相关系数R2=0.985 5，调整决定系数R2Adj=0.971 0，变异系数C.V.%=0.920 5，*表示在0.05水平显著，**表示在0.001水平显著。
方差来源 平方和 自由度 均值 F值 P值 显著性回归模型 9.93 14 0.71 67.93 <0.000 1 **A 0.11 1 0.11 10.65 0.005 7 *B 2.74 1 2.74 262.75<0.000 1 **C 0.69 1 0.69 66.31 <0.000 1 **D 0.35 1 0.35 33.35 <0.000 1 **AB 7.140×10-3 1 7.140×10-3 0.68 0.422 1 AC 0.098 1 0.098 9.36 0.008 5 *AD 0.088 1 0.088 8.42 0.011 6 *BC 0.10 1 0.10 9.90 0.007 1 *BD 0.043 1 0.043 4.12 0.061 7 CD 0.018 1 0.018 1.77 0.204 4 A2 2.91 1 2.91 278.94 <0.000 1 **B2 2.62 1 2.62 250.95<0.000 1 **C2 1.78 1 1.78 170.70 <0.000 1 **D2 1.42 1 1.42 136.17 <0.000 1 **残差 0.15 14 0.010失拟项 0.14 10 0.014 5.58 0.0560纯误差 9.770×10-3 4 2.443×10-3总和 10.07 28
由表3可以看出，F检验显示该模型有较高的F值（67.93）和极低的 P值（<0.000 1），可知该回归方程模型极显著；失拟项的P=0.056>0.05，失拟不显著。模型的相关系数R2和调整确定系数R2Adj分别0.985 5和0.971 0，说明97.1%响应值的变化是由独立变量决定。此外，失拟项的F=5.58，P=0.056，相对于纯误差不显著，即该模型与实际试验拟合程度较好，预测残差平方和为0.15，说明此模型解释变差的能力较强，总体拟合具有统计学意义，可以用来预测芹菜中黄酮提取工艺。
亦由表3方差分析结果知，模型的一次项A的P=0.0057在0.05水平显著，B、C和D的P均小于0.0001，则极显著；二次项 A2、B2、C2、D2的 P 均小于 0.000 1，则二次项均极显著；交互项AC、AD、BC在0.05水平显著，AB，BD，CD不显著。由此可以得到不同的提取条件与黄酮提取率之间不是简单的线性关系。另外，根据 F 值，A=10.65，B=262.75，C=66.31，D=33.35，很容易得各单个因素对黄酮提取率的影响顺序：B>C>D>A，即乙醇浓度>提取温度>提取时间>液料比。
2.2.3 响应曲面图和等高线图分析
利用软件对试验结果进行统计分析并生成响应曲面图和等高线图，如图5所示。
图5 响应曲面图和各因素交互影响的等高线图
Fig.5 Response surfaces and contours plots for flavonoids extracted from Celery
响应曲面图和等高线可以直观地展示各个变量试验值与响应值黄酮得率之间的关系，以及两个被测变量间交互作用的强弱，响应曲面坡度陡峭程度越明显，则响应值对试验条件的改变也越敏感。等高线图的形状可以清晰地反映两两被测变量交互影响作用的显著与否，椭圆形的等高线表示两两因素交互作用显著，反之等高线越圆则表明两两因素交互作用越不显著。从图5中可以看出，AC、AD和BC交互作用较显著，其余不显著。
根据Design-Expert软件的计算结果可得芹菜中黄酮提取的最佳工艺参数和理论提取率，结果见表4。
表4 提取工艺参数的优化
Table 4 The optimization of extration process
Y提取率/%编码值 0.098 0.439 0.327 0.238实际值 40.98 84.40 83.26 134.36 3.293项目 A液料比/（mL/g）B乙醇体积分数/%C提取温度/℃D提取时间/min
考虑到实际试验条件的关系，选择料液比41∶1（mL/g）、乙醇体积分数84%、提取温度83℃和提取时间134 min进行验证试验和重复性考察，得到芹菜黄酮的平均得率为3.276%（n=3），RSD=1.53%，稍低于理论得率，但在误差范围内，认为该工艺条件的优化结果具有较高的准确率。
本研究选择液料比、乙醇体积分数、提取温度和提取时间4个对芹菜黄酮提取率影响较大的因素进行单因素试验和Box-Behnken试验设计，根据响应面试验结果建立了相应的二次回归方程。方差分析和响应面分析结果表明4个因素及其二次项对黄酮提取率影响显著，料液比和提取温度、料液比和提取时间、乙醇体积分数和提取温度之间的交互作用显著。
通过相应面分析确定芹菜中黄酮提取的最佳的工艺条件为：液料比41∶1（mL/g），乙醇浓度84%，提取温度83℃，提取时间134 min，此时黄酮的提取率为3.276%（n＝3），RSD＝1.53%，略低于理论数据 3.293%，表明该方法可用于芹菜黄酮提取工艺的分析和预测，具有一定的可靠性。
参考文献：
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Optimization of Ethanol Extraction of Flavonoids from Celery by Response Surface Methodology
Abstract：The optimal extraction process of flavonoids from celery were investigated using ethanol as solvent by single factor experiment and response surface methodology.The effects of liquid-solid ratio，ethanol concentration，extraction temperature and extraction time on the flavonoids yield were discussed.Further，the predictive model of regression equation was established by Box-Behnken design.The results of Anova and response surface analysis indicate that，the flavonoids yield was significantly influenced by the 4 factors and their quadratic term.And the interactions were prominent among liquid-solid ratio，extraction temperature and extraction time，ethanol concentration and extraction temperature.Ultimately，the optimum extraction conditions were obtained as follows：liquid-solid ratio 41 ∶1 （mL/g），ethanol concentration 84%，extraction temperature 83 ℃ and extraction time 134 min.Under these conditions，the extraction rate is 3.276%.
Key words：celery；flavonoids；response surface methodology；process optimization
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.013
基金项目：徐州工程学院校级科研课题（XKY2013316）
收稿日期：2015-07-19