女贞花总黄酮提取及清除DPPH自由基作用的研究

（1.青岛农业大学，山东青岛266109；2.山东师范大学，山东济南250014）

摘要：在单因素试验的基础上，利用正交试验优化提取女贞花中总黄酮的工艺条件，并研究对DPPH自由基清除作用。结果表明：以0.5 g待测品为原料，按照1∶55（g/mL）料液比加入50%乙醇为提取剂，85℃恒温回流提取60 min为最佳提取工艺，女贞总黄酮提取率为12.57%（RSD=0.74）；女贞黄酮对DPPH自由基清除率IC50值为11.97 μg/mL，最大清除率82.06%。

女贞（学名Ligustrum lucidum）为玄参目木犀科女贞属常绿灌木或乔木，亚热带树种，原产中国，广泛分布在长江流域及以南地区，华北、西北地区也有栽培。女贞树枝叶茂密，树形整齐，对二氧化硫、粉尘等大气污染抗性较强，是园林绿化中应用较多的乡土树种。树高可达25 m，树皮灰褐色，单叶对生，圆锥花序顶生[1]。果实为女贞子，药用历史悠久，据《本草经疏》记载其“气味俱阴，正入肾除热补精之要品，肾得补，则五脏自安，精神自足，百病去而身肥健矣”[2]。临床上已证明，其具有滋养肝肾，强腰膝，乌须明目的功效，有很高的药用价值。

现代研究表明，女贞子、叶中含有女贞子甙、齐墩果酸、对-羟基苯乙醇、熊果酸、甘露醇、鼠李糖等30多种有效成份，还含有铜、铁、锌、锰、铬、镍等人体必需微量元素，具有明显的医疗保健作用和极高的营养价值，但是，对女贞花的相关研究却鲜见报道。本试验着重对女贞花中总黄酮的提取工艺及抗氧化性进行研究，以期为女贞花中有效成份的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大叶女贞花：由青岛农业大学植物保护学院罗兰教授采自青岛崂山并鉴定；芦丁标准品：国药集团化学试剂有限公司，批号20120514；抗坏血酸：天津市永大化学试剂有限公司；其它试剂均为分析纯；试验用水为蒸馏水。

UV-1601型紫外分光光度计：日本岛津公司；752N型紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；AR1140型电子天平：上海奥豪斯国际贸易有限公司；DZX-1型真空干燥箱：上海福玛实验设备有限公司；SHB-B88型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；SF-170型高速粉碎机：上海中药机械厂。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮含量的测定[3]

1.2.1.1 标准曲线的绘制

准确称取110℃干燥至恒重的芦丁标准品50.0mg，50%乙醇溶解，定容至250 mL，得对照品溶液。精密吸取对照品溶液 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00mL于25mL容量瓶中，加入50%乙醇10 mL，5%亚硝酸钠0.50 mL，摇匀放置5 min，10%硝酸铝0.50 mL，摇匀放置6 min，1 mol/L氢氧化钠5.00 mL，50%乙醇定容，摇匀放置25 min，于510 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，总黄酮含量为横坐标，绘制标准曲线，结果如图1。

对照品浓度对吸光度的线性方程为A=11.493 48c＋0.021 59，R=0.999 09，线性关系良好。

1.2.1.2 总黄酮提取率的测定

女贞花烘干粉碎过40目筛，加石油醚浸泡48 h，除去可溶性杂质，过滤晾干，得待测品；准确称取待测品0.5 g，回流提取，冷却过滤，定容至100 mL得待测液；准确移取待测液2.00 mL，按照上述方法，测定吸光度，平行3次，依据公式计算总黄酮提取率。

式中：A为吸光度；m为待测品质量，g。

1.2.2 提取溶剂的选择

控制提取温度为 85℃，料液比为 1∶55（g/mL），提取时间为 60 min，采用 5%NaHCO3、5%Na2CO3、0.2%NaOH、50%乙醇、50%甲醇、50%丙酮溶液、水，提取待测品总黄酮，采用1.2中方法测定总黄酮含量，选择合适的提取溶剂。

1.2.3 提取工艺最优参数的确定[4]

以待测品总黄酮提取率为考察指标，从乙醇浓度、提取温度、料液比、加热时间四方面进行试验，以确定各因素最优值，在此基础上设计四因素四水平正交表L16（44），进行正交试验，筛选最佳工艺条件。

1.3 DPPH自由基清除能力试验[5]

DPPH自由基可以稳定存在于有机溶剂中，由于1个稳定的DPPH自由基与抗氧化剂提供的1个电子配对结合，可使DPPH试剂的特征紫红色消失，因此可用来检测自由基清除情况，判断抗氧化性能力。

分别准确称取 DPPH 20.0 mg，VC12.5 mg，BHT 12.5 mg，50%乙醇定容至250 mL，得到的溶液质量浓度值分别为 DPPH 80 μg/mL，VC50 μg/mL，BHT 50 μg/mL，避光放置；将待测液合并稀释成总黄酮浓度为50μg/mL待测液，按表1所示加入反应液，50%乙醇将各管补充至10.00 mL，充分混匀后，暗处静置30 min，于517 nm波长处，分光光度法测定吸光度，重复3次。

DPPH自由基的清除能力（scavenging activity，SA）可用公式表示为：

式中：Ai为DPPH试剂与待测液反应后的吸光度；Aj为待测液与50%乙醇混合液的吸光度；A0为DPPH试剂与50%乙醇混合液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

在300 nm～600 nm波长范围内，对不同溶剂总黄酮提取液进行紫外可见光谱扫描结果见图2。

不同溶剂对提取率的影响结果见表2。

总黄酮提取率最高的溶剂为乙醇溶液，提取率达12.49%，甲醇溶液提取率最低为0.26%，0.2%NaOH、5%NaHCO3、5%Na2CO3的提取率依次为 7.64%、5.32%、4.26%，分析原因可能是碱性物质使母核发生变性等因素引起，丙酮和水提取率比较高，分别是9.45%、9.01%，但丙酮毒性较大，水提取物所含杂质较多。综上所述，确定乙醇溶液为最适提取溶剂。

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

准确称取待测品0.5 g，控制提取温度50℃，料液比 1 ∶55（g/mL），提取时间 60 min，设置不同乙醇浓度对待测品中的总黄酮进行提取。乙醇浓度对提取效果的影响见图3。

结果如图3所示，随着乙醇浓度的增大，提取率逐渐上升，60%后下降较大，浓度为50%～60%，提取率较高，因此，选取乙醇浓度40%、50%、60%、70%四水平，进行正交试验。

2.2.2 提温度对总黄酮提取率的影响

准确称取待测品0.5 g，控制料液比 1∶55（g/mL），乙醇浓度50%，提取时间60 min，设置不同提取温度提取待测品中的总黄酮。温度对提取效果的影响见图4。

结果如图4所示，随着温度的升高，提取率整体呈上升趋势，但提取温度较高会造成溶剂挥发，增加能源消耗，因此，选取 55、65、75、85℃为正交试验的 4个水平。

2.2.3 料液比对总黄酮提取率的影响

准确称取待测品0.5 g，控制乙醇浓度60%，提取温度85℃，提取时间60 min，设置不同料液比提取待测品中的总黄酮。料液比对提取效果的影响见图5。

结果如图5所示，随着料液比的增大，提取率逐渐上升，1 ∶55（g/mL）后略有下降，料液比为 1 ∶55（g/mL）时，总黄酮提取率较高，因此选取 1 ∶35、1 ∶45、1 ∶55、1 ∶65（g/mL）四水平。

2.2.4 提取时间对提取效果的影响

准确称取待测品0.5 g，控制提取温度85℃，料液比1∶55（g/mL），乙醇浓度60%，设置不同提取时间提取待测品中的总黄酮。提取时间对提取效果的影响见图6。

结果如图6所示，随提取时间的延长，提取率总体呈现上升趋势，60 min时黄酮类化合物的溶出已达12.53%，180 min时，提取时间增加了200%，提取率只提高了0.33%，另外延长时间会增加能耗，所以30、60、90、120 min为正交试验提取时间的四个水平，更加合理。

2.4 正交试验结果与分析

4种因素对总黄酮提取率的影响结果见表3。

影响次序为提取温度>乙醇浓度>提取时间>料液比，最优组合为：A4B1C3D4，由于提取时间对提取率的影响不大，为降低能耗，提高了效率，最终确定提取时间为60 min。

综上所述，女贞花总黄酮的最佳提取工艺条件为：0.5 g待测品，按照1∶55（g/mL）的料液比，加入 50%乙醇，85℃水浴加热60 min。

2.5 验证试验

准确称取待测品0.5 g，按照1∶55（g/mL）料液比，加入50%乙醇，85℃恒温水浴提取60 min，冷却过滤，滤液定容至100 mL，平行5次。准确移待测液2.0 mL，按1.2中方法，测定总黄酮提取率，结果见表4，总黄酮提取率为12.57%，该工艺条件有效可行。

2.6 DPPH自由基清除能力试验

DPPH自由基清除能力的试验结果见图7。

试验范围内，女贞花中总黄酮对DPPH自由基清除能力随浓度增加而增大，浓度为22.4 μg/mL时，达到最大抑制率82.06%。与VC、BHT相比，当总黄酮浓度<19.24 μg/mL时，清除能力VC>BHT>提取液；总黄酮浓度＞19.24 μg/mL 时，清除能力 VC＞提取液＞BHT；VC、提取液、BHT清除DPPH自由基的IC50值分别为5.58、11.97、13.95 μg/mL，因此，女贞黄酮有很强的抗氧化功效，值得深入研究其生理功能和开发功能产品。

3 结论

以芦丁为对照品，采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法，考察女贞花中总黄酮提取率；试验表明，乙醇溶液为最佳提取溶剂；通过单因素和正交试验，确定以0.5 g待测样品，按照 1∶55（g/mL）的料液比，加入 50%的乙醇为提取剂，85℃恒温回流提取60 min为最优工艺条件；该条件下总黄酮的提取率为12.57%（RSD＝0.74），该提取工艺操作简单，稳定可行。

女贞花中总黄酮对DPPH自由基的清除能力随浓度的增加而增大，浓度为22.4 μg/mL时，达到最大抑制率82.06%；VC、提取液、BHT清除DPPH自由基的IC50值分别为 5.58、11.97、13.95 μg/mL，从而证实女贞黄酮是一种有效的自由基清除剂。为以后女贞黄酮在保健食品、药品领域中的开发利用提供理论依据。

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Study on Extraction of Total Flavonoids in Ligustrum Flowers and Its Scavenging Activity on DPPH Free Radicals

YAO Wen-hong1，LI Fei-yang2，WANG Juan1，LUO Zhen1，HOU Ting1，*
（1.Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China；2.Shandong Normal University，Jinan 250014，Shandong，China）

Abstract：To optimize the extraction of total flavonoids in Ligustrum flowers and its scavenging activity on DPPH free radicals，the factors influencing the process parameters were determined by specotrophotometric method.The results showed the optimum conditions of the extraction were as followes：0.5 g of samples were used as the raw material，50%ethanol solution was used as the extraction solvent with a raw material to extraction solvent ratio of 1∶55（g/mL），and the reflux extraction was carried out in 85℃water bath for 60 min.The extraction rate was 12.57% （RSD=0.74）.The IC50value of DPPH free radical scavenging rate by flavonoids in Ligustrum flowers was 11.97 μg/mL，and the maximum the clearance rate of DPPH free radical was 82.06%.

基金项目：青岛农业大学高层次人才科研基金（663-1113320）；青岛农业大学大学生科技创新基金（2014305）

作者简介：姚文红（1968—），女（汉），副教授，学士，研究方向：生物产品的分离分析。