乳酸菌和酵母菌复合发酵南瓜汁工艺研究

梁莉1，程晨1，张柳茵1，谢学文2，陈信友3，李全宏1，*
（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081；3.北京市南口农场，北京102202）

摘　要：研究乳酸菌和酵母菌复合发酵南瓜汁的工艺，采用正交设计、感官评价等方式进行发酵南瓜汁工艺参数的优选、稳定剂和甜味剂的筛选。结果确定发酵种子培养基配方为：南瓜浆含量40%，葡萄糖2%，豆浆5%和碳酸钙0.4%。南瓜汁最佳发酵工艺为发酵温度36℃，酿酒酵母SY∶乳酸菌群=1∶3（体积比），接种量3%，发酵12 h后南瓜汁中乳酸菌的浓度可达9.20lg（CFU/mL）。

我国南瓜种植面积大、产量高，但大多被直接食用，附加值不高。近年来，利用益生菌发酵果蔬汁饮品的研究日益增多。发酵果蔬汁与普通果蔬汁相比，不但能够增加果蔬制品的营养保健功能，改善果蔬制品的风味，而且有利于延长食品保质期，提高经济效益［1-3］。目前，用于发酵果蔬汁的益生菌以乳酸菌为主，有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌等［4-7］。以多种乳酸菌和酵母菌共同发酵的研究还较少。贺银凤通过对传统发酵产品开菲尔及内蒙酸马奶酒的研究发现，酵母菌和乳酸菌之间有共生关系［8］。葛磊采用先乳酸菌后酵母菌的发酵方式开发了全燕麦发酵饮料［9］。本研究以南瓜汁为原料，选取前期筛选获得的3株优质的乳酸菌与酿酒酵母共同接种于南瓜汁中进行发酵试验，通过发酵工艺参数的优选为开发有活性的南瓜功能饮料提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料与设备

南瓜、马铃薯、大豆：购于北京美廉美超市；乳酸菌L.c、L.p、L.r：由中国农业大学食品学院天然产物实验室前期分离纯化筛选得到；酿酒酵母SY：购于安琪酵母股份有限公司。

LX-B35L型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：合肥华泰医疗设备有限公司；DHP-9082型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；BSA1245-CW分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；YT-CJ-1N型超净工作台：北京亚泰科隆实验科技开发中心；XW80A漩涡混合器：上海沪西分析仪器厂有限公司；FE20实验室pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司等。

1.2.1　种子培养基的优化

以南瓜浆作为乳酸菌的基础培养基，选取葡萄糖补充碳源，加入豆浆补充氮源，添加碳酸钙起缓冲作用，因为碳酸钙可以中和乳酸菌产生的乳酸，避免培养基pH过低，更好地促进乳酸菌的生长［10］。乳酸菌L. p、L.c、L.r以1∶1∶1（体积比）的接种量接种于培养基中，接种量为3%，在36℃下发酵12 h。采用L9（34）正交试验设计进行试验，对乳酸菌群的种子培养基进行优化。试验因素与水平见表1。

1.2.2　发酵工艺参数的优化

为确定南瓜汁发酵的最佳条件，选择发酵菌种配比，接种量，发酵温度，发酵时间4个因素分别进行单因素试验，根据单因素试验结果，选择菌种配比，发酵温度，接种量设计三因素三水平的正交试验，最终确定发酵最佳工艺。

1.2.2.1　发酵时间的选择

在待发酵南瓜汁中，按菌种配比（SY∶乳酸菌群=1∶2，体积比）接入3%的种子培养液，37℃静置发酵24 h，每2 h测定发酵过程pH的变化。

1.2.2.2　菌种配比的选择

发酵温度37℃，接种量为3%，发酵时间为12 h的条件下，采用不同菌种配比（SY∶乳酸菌群=1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，体积比）对南瓜汁进行发酵，根据pH、活菌数及感官得分确定最佳菌种配比。

1.2.2.3　接种量的选择

发酵温度37℃，菌种配比（SY∶乳酸菌群=1∶2，体积比），发酵时间为12 h的条件下，采用不同接种量（1%、2%、3%、4%、5%）对南瓜汁进行发酵，根据pH、活菌数及感官得分确定最佳接种量。

1.2.2.4　发酵温度的选择

在接种量为3%，菌种配比（SY∶乳酸菌群=1∶2，体积比），发酵时间12 h的条件下，采用不同发酵温度（30、33、36、39、42℃）对南瓜汁进行发酵，根据pH、活菌数及感官得分确定最佳发酵温度。

1.2.2.5　感官评价

采用评分检验法对发酵南瓜汁进行感官评价。分析评定的指标有色泽、香气、滋味和组织状态，各指标评分标准见表2。

综合得分为4个指标评分之和，即综合得分=色泽得分+香气得分+滋味得分+组织状态得分。

1.2.2.6　发酵工艺条件正交试验

在单因素试验结果的基础上，为进一步得到南瓜汁发酵的最佳工艺条件，对影响南瓜汁发酵的3个主要因素：菌种配比（1∶2、1∶3、1∶4，体积比），接种量（2%、3%、4%），发酵温度（34、36、38℃）进行优化组合，选用三因素三水平正交试验设计，测定发酵过程的pH、活菌数及感官得分，确定最佳发酵工艺条件。试验设计的各因素水平见表3。

2　结果与讨论

2.1　种子培养基的优化

正交试验结果见表4。

由表4的极差R值可以看出RD＞RB＞RA＞RC，即在正交试验所设计的各因素水平中，豆浆、南瓜浆、葡萄糖、碳酸钙的添加量对于种子液活菌数的影响依次增大，碳酸钙对活菌数的影响最大，葡萄糖次之，两种物质对于乳酸菌的生长作用明显。从表4还可以看出，活菌数对数最高的是A3B2C1D3，进一步绘制各因素水平趋势，如图1所示。

直观分析得出的最佳组合为A3B2C1D3，与正交试验结果一致，因此种子液培养基的最佳组合为A3B2C1D3，即南瓜浆含量40%，葡萄糖2%，豆浆5%和碳酸钙0.4%。

2.2　发酵工艺优化

2.2.1　发酵时间对发酵过程的影响

不同发酵时间对pH的影响见图2。

酸性饮料的pH一般为3.8～4.2。由图2可知，发酵时间对发酵过程pH变化影响显著。在发酵初始阶段（0 h～2 h），pH下降较慢，在发酵2 h～8 h时，各菌株生长旺盛，产酸较快，发酵10 h时，pH为4.09，已达到酸性饮料的要求，为了使发酵风味更好，适当延长发酵时间至12 h，此时pH为3.94，发酵液感官评分较高，所以确定发酵时间为12 h。

2.2.2　菌株配比对发酵过程的影响

不同菌种配比的选择对发酵过程的影响见表5。

从表5可以看出，在发酵温度为37℃，接种量为3%，发酵12 h的条件下，不同菌种配比对pH、乳酸菌活菌数及感官得分都具有显著性差异，菌种配比为1∶3（体积比）时，pH为3.89，感官得分为8.5，lg（CFU/mL）为9.13，此时感官得分较高，乳酸菌含量丰富，因此确定菌种配比为1∶3（体积比）。

2.2.3　接种量对发酵过程的影响

不同接种量对发酵的影响见表6。

由表6可以看出，不同接种量对于发酵过程具有显著性差异。随着接种量的增加，产酸增加，pH下降，感官评定分值升高，乳酸菌数量增加，当接种量为3%，继续增加接种量，pH变化不显著，感官得分及活菌数量均有所下降。因此，确定接种量为3%。

2.2.4　不同发酵温度对发酵的影响

不同发酵温度对发酵的影响见表7。

由表7可以看出，发酵温度对于产品风味和乳酸菌的含量有显著影响。当温度在30℃～39℃时，随着温度的升高，产酸增加，pH下降，产品风味较好，但是当温度大于36℃时，活菌数有所下降。因此，综合考虑，确定发酵温度为36℃。

2.2.5　发酵工艺优化结果

发酵工艺优化正交试验见表8。

从表8正交试验结果的极差分析可以看出，各试验组pH符合酸性发酵饮料的标准。就感官得分的影响因素而言，菌种配比、发酵温度、接种量对感官指标的影响依次减少。就乳酸菌活菌数的影响因素而言，接种量、发酵温度、菌种配比对活菌数的影响依次减少。进一步绘制各因素水平与感官得分、活菌数对数值的效应曲线图。

由效应曲线图3可知，对于感官得分的影响，各因素的最优水平为A2B2C2，从效应曲线图4可知，对活菌数的影响，各因素的最优水平为A2B2C2，最优组合一致。与试验中出现的两个最优组合A2B1C2和A2B2C3相比较，是由于因素B和C有差异。为了进一步确定结果，通过试验测定A2B2C2组的各项指标，得到pH3.83，感官得分8.9，lg（CFU/mL）为9.20，优于试验组A2B1C2和A2B2C3，因此，选择A2B2C2作为最佳发酵工艺条件，即发酵温度36℃，SY∶乳酸菌群=1∶3，接种量3%，发酵时间为12 h。

3　结论

本文以以南瓜汁为原料，通过多种乳酸菌和酵母菌共同发酵，开发了一款风味独特的南瓜汁发酵饮料。对发酵剂的种子培养基和发酵工艺进行了研究。确定乳酸菌种子培养基为以南瓜浆为基础，添加豆浆、葡萄糖以补充氮源及碳源、添加碳酸钙调节培养基pH。通过正交试验设计优化了种子培养基配方为：南瓜浆含量40%，葡萄糖2%，豆浆5%和碳酸钙0.4%。在此条件下，乳酸菌对数值可以达到9.37。对发酵过程中对酿酒酵母和乳酸菌群的菌种配比、接种量、发酵温度、发酵时间进行优化，确定了最佳发酵工艺：发酵温度36℃，酿酒酵母SY∶乳酸菌群（体积比）= 1∶3，接种量3%，发酵时间为12 h。

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Study on the Processing Technique of Pumpkin Juice Co-fermented by Lactic Acid Bacteria and Yeast

LIANG Li1，CHENG Chen1，ZHANG Liu-yin1，XIE Xue-wen2，CHEN Xin-you3，LI Quan-hong1，*
（1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China；2.The Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agriculture Sciences，Bejing 100081，China；3.Beijing Nankou Farm，Beijing 102202，China）

Abstract：Orthogonal experiment and sensory evaluation were used to study the suitable processing technique of pumpkin juice co-fermented by lactic acid bacteria and yeast，inculuding fermentation process optimization，screening of sweeteners and stabilizers and prediction of storage time.The result showed that the optimized medium formulation for seed culture was as follow：the pumkin juice content was 40%，the glucose level was 2%，the soybean milk level was 5%and the calcium carbonate level was 0.4%.With the fermentation temperature of 36℃，inoculum concentration of 3%，inoculation ratio of 1∶3 and fermentation time of 12 h，the numbers of lactic acid bacteria in pumpkin juice could be achieved 9.20 lg（CFU/mL）in the end of fermentation.

Key words：lactic acid bacteria；yeast；pumpkin juice；processing technique；living bacteria

基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费资助项目（201303112）作者简介：梁莉（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏。

*通信作者：李全宏，教授，博士，主要从事天然产物化学研究。

乳酸菌和酵母菌复合发酵南瓜汁工艺研究

1 材料与方法

2 结果与讨论

3 结论

1　材料与方法

2　结果与讨论

3　结论