摘 要：建立葡萄酒中多种糖醇的高效液相色谱检测方法。采用色谱柱WatersXbridgeAmide（3.5μm，4.6mm×250mm），流动相为丙酮-水［77∶23（体积比），并在每1 000 mL丙酮-水流动相中加入三乙胺0.23 mL］，用示差折光检测器进行检测。丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的线性范围为0.084 mg/mL～100 mg/mL，最低检出限为0.016 mg/mL～0.282 mg/mL，3种葡萄酒样品中4种糖醇的回收率为75.682%～115.476%，相对标准偏差为0.022～3.682，该方法应用于葡萄酒中糖醇的检测快速、准确、高效。
关键词：高效液相色谱法；示差折光检测器；麦芽糖醇；糖醇；葡萄酒
麦芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇、丙三醇这几种常见的糖醇经常应用或是存在于我们日常的食品中。糖醇是糖的加氢还原产物，拥有甜度低、热量低等特点，是一类新型的甜味剂，经常被应用于低糖食品，糖尿病人保健食品以及低能量低糖功能性食品。
葡萄酒是一种营养丰富的饮料，富含人体所需的维他命、糖及微量元素，具有促进血液循环、降低血脂、软化血管等功效。随着人们生活水品的提高，葡萄酒这种以前相对高端小受众的商品逐渐走上了平常百姓的日常餐桌。在中国，人们受喝酒习俗及口味的影响，红酒的销售量很大，人们红酒的摄入量也很大，而且中国人对干红、干白葡萄酒这类传统的葡萄酒其酸涩口味喜爱度不是特别高，更喜爱含糖量较高、口感较甜的半甜、甜型葡萄酒类，由于对甜度的追求使部分葡萄酒生产者在葡萄酒加工中添加甜味剂。所以为了判定葡萄酒的优劣，既具有有益的营养物质又具有调节口味作用的糖醇在红酒的检测中就越来越多，作为新型甜味剂类的糖醇检测也越来越被重视。
国内糖醇的研究多集中在配制乳，发酵乳等检测方面，对葡萄酒中的糖醇检测涉及很少，所以本试验研究一种测定葡萄酒中多种糖醇的检测方法。
1.1 试剂、标准品与样品
麦芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇、丙三醇，纯度均＞99%；丙酮（色谱纯）；三乙胺（优级纯）；乙酸锌（分析纯）；亚铁氰化钾（分析纯）；试验用水Millipore超纯水。
干白葡萄酒、干红葡萄酒、甜型葡萄酒以及起泡酒等本试验用酒均为市售商品。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪1100（配示差折光检测器）：美国Agilent公司；液相色谱柱WatersXbridgeAmide（3.5μm，4.6 mm×250 mm）：美国Waters公司；MILLI-Q纯水仪：MilliPore公司；MS 3 basic混匀器：美国IKA公司；KQ-100E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；PL602-S天平：Mettler-Toledo公司；CR22GⅢ离心机：日本HITACHI；移液枪（10-100 μL，20-200 μL，100-1000 μL，5000 μL）：Eppendorf公司；0.22 μm滤膜：德国Membrana公司；22%乙酸锌（纯度99.0%）：天津市化学试剂三厂；10.6%亚铁氰化钾（纯度99.5%）：医药集团上海化学试剂公司。
1.3 色谱条件
色谱柱：Waters Xbridge Amide（3.5 μm，4.6 mm× 250 mm）；流动相：单流动相（丙酮 ∶水=77∶23，每1 000 mL流动相加入0.230 mL三乙胺）等度洗脱；柱温：70℃；流速：0.8 mL/min；进样量：10 μL。
1.4 标准溶液配置
分别取适量麦芽糖醇、木糖醇、山梨糖醇、丙三醇标准品，配成标准储备液，待用。
标准储备液浓度及标准系列溶液浓度如表1。
表1 标准储备液浓度及标准系列溶液浓度
Table 1 Concentration of standard stock solution and standard series
名称 储备液浓度/（mg/mL） 标准系列浓度/（mg/mL）丙三醇 500 0.084 0.168 0.335 0.670 100木糖醇 50.0 0.623 1.245 2.490 4.980 20.0山梨糖醇 40.0 0.806 1.613 3.225 6.450 20.0麦芽糖醇 40.0 1.175 2.350 4.700 9.400 20.0
1.5 样品前处理
称取均匀的待测样品10.0 g（精确至1.0 mg）放入100 mL容量瓶中，加水30 mL稀释溶解，分别缓慢加入22%乙酸锌溶液2.5mL和10.6%亚铁氰化钾溶液2.5 mL，混匀，静置至室温，再加入水定容至100 mL，混匀后，离心机离心，取上清液，用0.22 μm针头滤膜过滤待测。
另：对起泡酒类需用超声波清洗器消泡后称取待测。
2.1 色谱柱的选择
本试验选取Agela NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）和Waters Xbridge Amide（3.5 μm，4.6 mm×250 mm）两款色谱柱进行比较。
Agela NH2为糖类分析传统的氨基柱，在日常的分析中可以发现，随着分析量的加大，尤其是在分析组分较复杂的样品，例如葡萄酒类时，此类氨基柱样品分离度下降很明显，且木糖醇与山梨糖醇不能完全分离。选择WatersXbridgeAmide（3.5μm，4.6mm×250mm）色谱柱，木糖醇与山梨糖醇完全分离，如图1。
图1 流动相未加三乙胺时4种糖醇色谱图
Fig.1 Four types of sugar alcohols chromatogram used mobile phase without triethylamine
1.丙三醇；2.木糖醇；3.山梨糖醇；4.麦芽糖醇。
且分离度下降比较缓慢，系统较易平衡，所以选择Waters Xbridge Amide（3.5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱。丙酮∶水=77∶23，每1 000 mL流动相加入0.230 mL三乙胺为流动相。
2.2 流动相的选择
本试验选取乙腈水和丙酮水两种流动相进行比较。糖类分析传统的氨基柱，应用乙腈水为流动相，但是在分析多组分糖类及糖醇时，由于部分检测物结构和分子量上的相似，所以不能完全分离。选择丙酮∶水= 77∶23为流动相，流动相偏正相，糖醇分离度加大，但是对于木糖醇与山梨糖醇还是不能完全分离，如图1，所以加入三乙胺，进一步加大分离度，分别在1000mL流动相中加入0.100、0.200、0.230、0.300mL三乙胺进行分析，加入三乙胺分离效果图，如图2。
图2 加入三乙胺分离效果图
Fig.2 Triethylamine separation rendering phase without triethylamine
试验得出随着三乙胺加入量的加大，糖醇的分离度加大，木糖醇与山梨糖醇可以完全分离，但是三乙胺加入到0.230 mL以后，随着加入量的加大分离度没有明显的变化，所以选择每1 000 mL流动相加入0.230 mL三乙胺。加入三乙胺后葡萄酒添加色谱图如图3。
图3 干红葡萄酒添加色谱图
Fig.3 The red wine with adding stardard chromatogram
最终确定丙酮∶水=77∶23，每1000mL流动相加入0.230mL三乙胺为流动相，4种糖醇色谱图，如图4，干白葡萄酒色谱图如图5，干红葡萄酒色谱图如图6，甜白葡萄酒色谱图如图7。
图4 4种糖醇色谱图
Fig.4 Four types of sugar alcohols chromatogram
1.丙三醇；2.木糖醇；3.山梨糖醇；4.麦芽糖醇。
图5 干白葡萄酒色谱图
Fig.5 The white wine chromatogram
图6 干红葡萄酒色谱图
Fig.6 The red wine chromatogram
图7 甜白葡萄酒色谱图
Fig.7 The sweet wine chromatogram
2.3 线性范围、检出限、精密度和重现性
以2.1、2.2选择的色谱条件进行检测得出干白葡萄酒、干红葡萄酒、甜白葡萄酒中糖醇检出情况，如表2。
表2 葡萄酒中糖醇的含量
Table 2 The content of sugar alcohol in wine mg/g
注：ND表示没有检出。
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由图5看出，葡萄酒谱图基线比较平稳，糖醇可以被完全分离，因为不同糖醇的检测信号响应有差别，所以检出限有比较大的差别，表3为葡萄酒中4种糖醇线性方程。
由表3可以得出，4种糖醇相关系数均在0.99以上，线性较好，线性范围为0.084 mg/mL～100mg/mL，最低检出限为0.016 mg/mL～0.282 mg/mL，线性范围比较大，且灵敏度较高。
干红葡萄酒添加色谱图，如图5，对3种葡萄酒中4种糖醇进行添加回收验证，如表4。
表3 葡萄酒中4种糖醇线性
Table 3 The linears of 4 types of sugar alcohols in wine
名称 曲线方程（y表示浓度Amt表示峰面积） 相关系数 线性范围/（mg/mL） 检出限/（mg/mL）丙三醇 y=369 646.615×Amt-4 041.399 9 0.999 57 0.084～100 0.016木糖醇 y=43 931.395 4×Amt-2 333.099 9 0.999 66 0.623～20 0.141山梨醇 y=39 815.763 8×Amt-105.080 9 0.999 86 0.806～20 0.172麦芽糖醇 y=32 865.213 1×Amt-6 365.741 8 0.998 65 1.175～20 0.282
表4 3种葡萄酒中4种糖醇回收率
Table 4 The Recoveries of 4 Types of Sugar alcohols in 3 Types of Wine
干白葡萄酒回收率/%丙三醇 0.132 0.112 84.848 0.117 90.000 0.100 75.682 0.241 0.199 82.573 0.228 94.398 0.206 85.477 0.420 0.414 98.571 0.485 115.476 0.440 104.667木糖醇 1.212 1.082 89.299 1.023 84.398 1.144 94.356 1.824 1.520 83.333 1.982 108.657 2.067 113.306 4.080 4.036 98.931 3.701 90.701 4.179 102.424山梨糖醇糖醇 添加量/（mg/g）干红葡萄酒 甜白葡萄酒实测值/%回收率/%实测值/%回收率/%实测值/% 1.233 1.001 81.176 1.022 82.847 1.184 96.041 1.932 1.746 90.373 2.029 105.016 1.951 101.004 4.034 4.386 108.705 4.366 108.222 3.920 97.159麦芽糖醇2.544 2.149 84.470 2.770 108.892 2.550 100.259 3.679 3.366 91.487 3.793 103.096 3.993 108.521 6.878 7.640 111.072 7.739 112.504 7.484 108.807
由表4可以看出，3种葡萄酒中4种糖醇的3种不同浓度回收率均在75.682%～115.476%之间，回收率较好。
3种葡萄酒在3种不同浓度下4种糖醇的精密度如表5所示。
表5 3类葡萄酒中4种糖醇精密度（n=6）
Table 5 The precision of 4 types of sugar alcohols in 3 types of wine（n=6）
由表5可以看出，此方法的相对标准偏差为0.022～3.682之间，精密度比较高，重现性比较好。
本试验主要是通过对3种常见的葡萄酒（干白葡萄酒、干红葡萄酒、甜白葡萄酒）基质进行试验研究，通过色谱柱、流动相选择等方法，建立了能够适合葡萄酒基质的色谱条件，从而对葡萄酒建立系统和完整的高效液相色谱检测方法。丙三醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇的线性范围为0.084 mg/mL～100 mg/mL，最低检出限为0.016 mg/mL～0.282 mg/mL，3种葡萄酒样品中4种糖醇的回收率为75.682%～115.476%，相对标准偏差为0.022～3.682，结果表明：此方法的精密度，重复性良好。
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Determination of Multiple Sugar Alcohols in Wine by HPLC
Abstract：A method was established to determine multiple sugar alcohol in wine by HPLC.Use colume of Wa ters Xbridge Amide（3.5 μm，4.6 mm×250 mm），Mobile phase was acetone water（77∶23，volume ratio，0.230 mL triethylamine per 1 000 mL acetone water）by RID.The linear range of glycerol，xylitol，sorbitol，maltitol were 0.084 mg/L-100 mg/L.Limit of minium detection were 0.016 mg/mL-0.282 mg/mL.The sample recoveries were 75.682%-115.476%，relative standard precisionswere 0.022-3.682.The method wasrapid，accurate，efficient.
Key words：HPLC；RID；maltitol；sugar alcohols；wine
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.035
收稿日期：2015-09-30