表1 流动相梯度
Table 1 The gradients of mobile phase
时间/min A溶剂/% B溶剂/% 流量/（mL/min）0 20 80 1.0 5 35 65 1.0 10 80 20 1.0 16 80 20 1.0 18 20 80 1.0 28 20 80 1.0
摘 要：建立熟肉制品中5种合成色素的高效液相色谱法测定方法。熟肉制品经过脱脂后提取色素，选择样品中5种色素的最大吸收波长用高效液相色谱仪分析测定。在0.10μg/mL～50.0μg/mL线性范围内，所得5种合成色素的回归方程均呈较好的线性关系（r＞0.999）。该方法的检出限为0.035μg/mL～0.040μg/mL，相对标准偏差在0.79%～1.30%之间。对样品进行加标回收试验，绝对回收率在91.5%～101.0%之间。本方法简便、快速、准确，适用于熟肉制品中合成色素的测定。
关键词：熟肉制品；色素；脱脂；最大吸收波长；高效液相色谱法
色素作为食品添加剂，可分为天然色素和人工合成色素两大类［1］，天然色素来源自然、安全性较高。人工合成色素即用人工化学合成方法所制得的有机色素。色素本身无营养价值，但由于其色泽鲜艳，着色力强，色调多样，成本低廉，能够增加食物感官美和提高人们的食欲，在食品行业被广泛应用。研究表明，过量摄入人工合成色素对人体有致突变、致泻性和致癌性。目前国标GB/T 5009.35-2003《食品中合成着色剂的测定》［2］中针对熟肉制品人工合成色素的检测方法的专属性不强，熟肉制品中脂肪、蛋白质含量高，样品难以提取，回收率低。本文在原有标准的基础上改进了熟肉制品中合成色素的前处理方法和检测条件，获得满意效果。
1.1 仪器
e2695高效液相色谱仪：Waters；超纯水机：美国millipore，Milli-Q Advantage A10；SHB-Ⅲ循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；C-50抽滤器：北京众意中和生物技术有限公司；G3垂融漏斗：江苏省宝应县正茂玻璃厂；针式过滤头：上海兴亚净化材料厂，0.45 μm；高速离心机：Thermo，Sorvall ST 16R；SZ-1型快速混匀器：江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；WHY-2型恒温水浴振荡仪：金坛市精达仪器制造有限公司；HWS 26型电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司。
1.2 试剂
色谱纯甲醇（美国迪马公司）；超纯水（电导率＜0.10 S/m，25℃）。
柠檬黄标准溶液GBW（E）100001a、日落黄标准溶液GBW（E）100003a、苋菜红标准溶液GBW（E）100002a、胭脂红标准溶液GBW（E）100004a，以上4种标准溶液浓度均为0.500 mg/mL，定值单位为中国计量科学研究院，诱惑红标准溶液GBW（E）100164，浓度值为1.00 mg/mL，定值单位北京海岸鸿蒙标准物质技术有限公司。
乙酸铵溶液（优级纯，天津市巴斯夫化工有限公司，0.02 mol/L）；海砂（化学纯，国药集团化学试剂有限公司，先用10%体积浓度盐酸溶液浸泡煮沸15 min，冷却，用水洗至中性，再用50 g/L氢氧化钠溶液煮沸15 min，冷却，用水洗至中性，于105℃干燥，贮于具塞瓶中。）；石油醚（分析纯，天津市化学试剂一厂，30℃～60℃）；无水乙醇-氨水-水混合溶液（均为优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；10%体积浓度硫酸溶液（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；钨酸钠溶液（分析纯，天津市天津市化学试剂一厂，100 g/L）；聚酰胺粉（江苏无锡化学试剂有限公司，200目）；甲醇-甲酸溶液（均为优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸溶液（分析纯，上海试剂一厂，20%）。
1.3 预处理
准确称取粉碎试样5 g于研钵中，加海砂少许研磨混匀，吹风使试样干燥。加入石油醚，涡旋，离心，弃去石油醚。残渣重复上述去脂过程3次，除去脂肪，吹干。脱脂后的试样转移至50 mL离心管中，加入30 mL无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，体积比），振荡，离心，将上层液体倒入100 mL的锥形瓶中，再向离心管中加入10 mL无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，体积比），重复上述操作，反复多次至提取液无色为止。合并提取液于70℃水浴上浓缩至10 mL以下，依次加入硫酸溶液1.0 mL和100 g/L钨酸钠溶液1.0 mL，混匀，继续70℃水浴加热5 min，沉淀蛋白质。取下锥形瓶，冷却至室温，用滤纸过滤，少量水洗涤滤纸，滤液收集与100 mL烧杯中。
1.4 色素提取
用柠檬酸溶液将依法制成的样品溶液调pH值到6，加热至60℃，加入适量的聚酰胺粉调成粥状，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3次～5次，然后用甲醇-甲酸溶液（6∶4，体积比）洗涤3次～5次，再用水洗至中性，用无水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，体积比）解吸3次～5次，每次5 mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加超纯水溶解，定容至5mL。经0.45μm滤膜过滤，供HPLC测定。
1.5 高效液相色谱法的测定
1.5.1 标准系列的配制
准确吸取柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红标准溶液各1.0、3.0、10.0、30.0、100.0、500.0 μL；诱惑红标准溶液各0.50、1.50、5.0、15.0、50.0、250.0 μL置于5 mL容量瓶中，用超纯水稀释到刻度，得到0.10、0.30、1.0、3.0、10.0、50.0 μg/mL的标准系列。
1.5.2 色谱条件
色谱柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；进样量：20 μL；柱温：30℃；检测波长：柠檬黄428nm、日落黄483nm、诱惑红507nm、胭脂红509nm、苋菜红521 nm；流动相及梯度（A：色谱纯甲醇；B：0.02 mol/L乙酸铵溶液）。梯度如表1。
表1 流动相梯度
Table 1 The gradients of mobile phase
时间/min A溶剂/% B溶剂/% 流量/（mL/min）0 20 80 1.0 5 35 65 1.0 10 80 20 1.0 16 80 20 1.0 18 20 80 1.0 28 20 80 1.0
2.1 样品前处理方法
2.1.1 样品提取条件的优化
首先用石油醚对样品进行脱脂，减少了脂肪对溶出色素的影响，结果提高了样品的回收率和重现性。利用无水乙醇-氨水-水溶液作为提取溶剂，能够提高色素的溶出度，同时减少蛋白溶出的影响［3］。
2.1.2 聚酰胺粉的使用量
聚酰胺是具有酸碱二极性的化合物，在酸性条件下与水溶性酸性染料结合，而与天然色素、淀粉等物质分离。聚酰胺粉的使用量根据样品中色素的含量而改变［4］。一般样品用1 g的聚酰胺粉调成糊状即可，色素含量高的样品，可以减少样品量或者增加聚酰胺粉的使用量。
2.1.3 无水乙醇-氨水-水的用量
预处理中首次加入30 mL无水乙醇-氨水-水体积比为7∶2∶1提取，色素含量小于等于0.15 g/kg的样品再次各加入10 mL无水乙醇-氨水-水体积比为7∶2∶1提取3次即可，色素含量大于0.15 g/kg的样品需重复提取4次。
2.2 检测波长的选择
2.2.1 色素的化学性质
柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红均为水溶性酸性染料，结构中含有不同数量的苯磺酸基，在紫外区有较强的吸收特征［5］。本试验采用二极管阵列检测器，在200 nm～700 nm之间对5种合成色素进行光谱扫描。结果发现，5种物质的最大吸收波长λmax如下：柠檬黄428 nm、日落黄483 nm、苋菜红521 nm、胭脂红509 nm、诱惑红507 nm。
2.2.2 波长λ254下各色素的响应值
GB/T 5009.35-2003采用的是λ254时进行色素检测，因此取10.0 μg/mL的5种色素的混标20 μL，在λ254下按照色谱条件进行检测，各色素的响应值色谱图见图1。
图1 5种色素标准色谱图
Fig.1 Chromatogram of 5 kinds of pigment standard
5种色素的检测限为柠檬黄0.050 μg/mL、日落黄0.050 μg/mL、苋菜红0.040 μg/mL、胭脂红0.040 μg/mL、诱惑红0.055 μg/mL。
2.2.3 最大吸收波长λmax下各色素的响应值
用PDA检测器对5种合成色素进行检测时，可以同时5个波长进行检测，即同一时间测定5个波长的响应值。取10.0 μg/mL的5种色素的混标20 μL，按照色谱条件进行检测，各色素的响应值色谱图见图2～图6。
图2 柠檬黄标准的色谱图
Fig.2 Chromatogram of Tartrazine standard
图3 胭脂红标准的色谱图
Fig.3 Chromatogram of Ponceau 4R standard
图4 日落黄标准的色谱图
Fig.4 Chromatogram of Sunset yellow standard
图5 苋菜红标准的色谱图
Fig.5 Chromatogram of Amranth standard
图6 诱惑红标准的色谱图
Fig.6 Chromatogram of Allura red standard
5种色素在最大吸收波长下的检出限为柠檬黄0.035 μg/mL、日落黄0.035 μg/mL、苋菜红0.040 μg/mL、胭脂红0.040 μg/mL、诱惑红0.035 μg/mL。可见选择最大吸收波长时，5种色素的灵敏度显著提高，响应值增加了1到1.6倍，峰形更加尖锐，降低了方法的检出限。
2.3 线性范围和检出限
分别取5种色素的混标标准系列20 μL，按照色谱条件进行检测，可测得5种色素6个浓度响应值峰面积，以浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，方法的线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限见表2。
表2 5种色素的线性范围、回归方程、相关系数及检出限
Table 2 Linearity range，calibration curve，correlation and detection limit of five pigment
?
从表2可以看出，5种合成色素的线性关系良好。以3倍基线噪音确定检出限浓度。
2.4 方法准确度、精密度和回收率测定
在腊肠、火腿肠、红肠样品中分别加入标准曲线范围内高、中、低3个浓度的色素标液，每一个浓度平行制作6份，连续6 d，按照1.3、1.4样品处理进行试验，考察方法的日内、日间精密度及绝对回收率。试验结果列于表3～表5中。
表3 腊肠样品加标试验数据
Table 3 Experimental data of spiked Sausage samples
绝对回收率/%柠檬黄 0 1.0 0.96 1.12 92.9 0 10.0 1.01 1.10 95.0 0 50.0 0.97 0.99 98.9苋菜红 0 1.0 0.89 0.95 95.9 0 10.0 1.03 1.21 98.2 0 50.0 0.79 0.87 99.1胭脂红 0 1.0 1.04 1.30 93.8 0 10.0 0.95 1.25 96.2 0 50.0 1.00 1.14 99.4日落黄 0 1.0 0.98 1.00 91.5 0 10.0 0.91 0.98 98.1 0 50.0 0.82 1.01 99.4诱惑红 0 1.0 1.04 1.11 92.1 0 10.0 0.93 1.21 95.9 0 50.0 0.89 0.99 92.9色素 本底值/（μg/mL）加标量/（μg/mL）日内精密度RSD/%日间精密度RSD/%
表4 火腿肠样品加标试验数据
Table 4 Experimental data of spiked ham sausage samples
绝对回收率/%柠檬黄 0 1.0 0.97 1.08 98.0 0 10.0 1.05 1.14 94.9 0 50.0 0.79 0.96 97.8苋菜红 0 1.0 0.84 0.99 91.9 0 10.0 1.06 1.25 97.2 0 50.0 0.83 0.92 96.1胭脂红 0 1.0 1.13 1.25 96.9 0 10.0 0.95 1.20 92.2 0 50.0 1.00 1.19 99.3日落黄 0 1.0 0.99 1.05 94.8 0 10.0 0.99 0.98 95.1 0 50.0 0.92 1.11 99.8诱惑红 0 1.0 1.09 1.19 95.1 0 10.0 0.99 1.01 92.9 0 50.0 0.86 0.99 98.9色素 本底值/（μg/mL）加标量/（μg/mL）日内精密度RSD/%日间精密度RSD/%
以上试验结果RSD值均＜1.5%，精密度和绝对回收率结果令人满意。
2.5 样品分析结果
分别取腊肠、火腿肠、红肠各10份样品进行柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红5种色素测定。称取5 g样品按照1.3进行样品预处理，再按照1.4进行色素提取，进样20 μL于高效液相色谱仪中进行分析。试验结果如下：腊肠中胭脂红检出率为20%，诱惑红检出率为10%，其他3种色素未检出，均未超过国家标准，合格率100%；火腿肠中诱惑红检出率为40%，1份超过国家标准，超标率10%，其他4种色素未检出；红肠中胭脂红检出率10%，诱惑红检出率为60%，均未超过国家标准，合格率100%。
表5 红肠样品加标试验数据
Table 5 Experimental data of spiked red-sausage samples
绝对回收率/%柠檬黄 0 1.0 0.89 1.16 92.4 0 10.0 1.03 1.15 98.0 0 50.0 0.96 0.98 94.9苋菜红 0 1.0 0.84 0.96 92.9 0 10.0 1.08 1.24 98.7 0 50.0 0.80 0.86 97.9胭脂红 0 1.0 1.08 1.24 91.9 0 10.0 0.95 1.25 101.0 0 50.0 1.01 1.24 99.1日落黄 0 1.0 0.98 1.00 94.8 0 10.0 0.96 0.98 98.4 0 50.0 0.89 1.02 100.2诱惑红 0 1.0 1.03 1.15 92.8 0 10.0 0.92 1.20 100.7 0 50.0 0.93 0.94 92.2色素 本底值/（μg/mL）加标量/（μg/mL）日内精密度RSD/%日间精密度RSD/%
试验结果表明，通过优化试验条件，样品经过石油醚脱脂后、利用无水乙醇-氨水-水溶液作为色素溶出剂，溶出后过滤、提取色素，选择熟肉制品中5种色素的最大吸收波长用高效液相色谱仪分析测定，分辨率高，灵敏度高，检出限低，测定快速、简便，可作为检测熟肉制品中合成色素的一种准确、可行的分析方法。
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Improvement of 5 Synthetic Pigment with HPLC Method for the Determination of Cooked Meat Products
Abstract：To establish a HPLC method for the determination of 5 kinds of synthetic pigment in cooked meat products，the selection of the maximum absorption wavelength of 5 synthetic pigment in the samples was determined by high performance liquid chromatography analysis，after the degreasing of the cooked meat products and the pigment extraction.The obtained regression equations of 5 kinds of synthetic pigment showed a good linear relationship（r＞0.999）in 0.10 μg/mL-50.0 μg/mL linear range，with the detection limit of 0.035 μg/mL-0.040 μg/mL，and the relative standard deviation was between 0.79%to 1.30%.The samples were spiked with recovery experiment，and the absolute recoveries were in the range of 91.5%-101.0%.The method is simple，rapid，accurate，which is suitable for determination of the synthetic pigment in cooked meat products.
Key words：cooked meat products；pigment；degreasing；maximum absorption wavelength；HPLC
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.033
收稿日期：2015-04-14