图1 α-酸和iso-α-酸的化学结构式
Fig.1 Chemical structure of α-acid and iso-α-acid
摘 要：啤酒花是一种重要的风味剂，也是酿造啤酒的重要原料。本文采用紫外分光光度法测定了6种不同品牌啤酒中异-酸（iso-α-酸）的含量。试验考察了不同表面活性剂、介质酸度对iso-α-酸紫外吸收的影响。结果表明：iso-α-酸在258 nm处有较强的吸收，方法线性范围在10 μg/mL～50 μg/mL，相关系R=0.999 4，RSD=1.40%（n=5）。通过比较说明β-环糊精（β-CD）对iso-α-酸的增敏作用最强，SDS次之，曲拉通-100最弱。6种不同品牌啤酒中iso-α-酸的含量（μg/mL）依次为：司陶特黑啤酒（130.33）＞燕京啤酒（67.45）＞哈尔滨啤酒（58.14）＞崂山啤酒（39.62）＞纯生啤酒（38.76）＞雪花啤酒（35.53）。用标准加入法测定其回收率，样品回收率范围在96.30%～104.70%之间，结果满意。
关键词：啤酒；异α-酸；β-CD；紫外分光光度法
啤酒花［1］学名蛇麻（Lumpulus L.），又名Hop，香蛇麻花、酒花、野酒花，为桑科草属多年生攀援草本植物，雌雄异株，单花性，雄性球穗花序简称酒花。它是一种较耐旱不耐热的植物，主要分布于我国西北地区、新疆北部、东北、华东、及山东、甘肃、陕西等地。酒花成分很复杂，文献报道［2-3］啤酒花中含有十几类化学物质，其中包括树脂类、挥发油、黄酮类、鞣质、胆碱、粗纤维、氨基酸等多种化学成分。正是由于啤酒花中大量功效成分的存在，啤酒花提取物及其复方制剂具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、镇静、雌性激素样等多种生物活性。德国人首先在酿制啤酒时添加了酒花，从而使啤酒具有了清爽的苦味和芬芳的香味。酒花被誉为“啤酒的灵魂”，成为啤酒酿造不可缺少的主要原料之一。啤酒花的有效成分是酒花树脂α-酸［4-5］，由于α-酸的酰基中饱和烃侧链不同，分别含有3种不同组分：共葎草酮、律草酮和近葎草酮。啤酒在发酵过程中，α-酸转化为更为稳定的iso-α-酸（反应见图1），不仅苦味度增加，而且其对光的稳定性也有较大的改善。
图1 α-酸和iso-α-酸的化学结构式
Fig.1 Chemical structure of α-acid and iso-α-acid
目前，测定啤酒花中α-酸的主要方法有高效液相色谱法［6-7］，电导滴定法［8］、薄层色谱法［9］等。虽然高效液相色谱方法测定的准确度高、重现性较好，但仪器昂贵、操作复杂。经文献调研，采用紫外分光光度法测定相关iso-α-酸研究报道比较少见。
本研究工作采用紫外分光光度法，探讨了不同表面活性剂、酸度对iso-α-酸紫外吸收的影响，测定了市场上6种品牌啤酒中iso-α-酸含量［10］，对不同人群选择市场中自己喜爱的风味啤酒饮品有一定的指导价值。
1.1 仪器
UV-2550型紫外分光光度计：日本岛津公司；pHS-3TC（0.01级）精密pH计：上海精密科学仪器有限公司；HH-2型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；JJ-1精密定时电动搅拌器：金坛市荣华仪器制造有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化科技公司；AB204-N型电子分析天平：Mettler-Toleclo Group公司。
1.2 试剂与材料
甲醇（≥99.5%）：天津市风船化学试剂科技有限公司；氢氧化钠：天津市北辰方正试剂厂；碳酸氢钠：北京化学试剂公司；甲苯：天津市风船化学试剂科技有限公司；盐酸：太原化肥厂化学试剂厂；磷酸：天津市化学试剂三厂；乙酸：天津市化学试剂二厂；硼酸：天津市北辰方正试剂厂；40%啤酒花浸膏：甘肃天工生物科技有限公司；Brij35（聚氧乙烯月桂醚）：Alfa Aesar公司；SDS（十二烷基硫酸钠，分析纯）：Sigma公司；TritonX-100（曲拉通X-100，化学纯）：北京化学试剂公司；β-CD（β-环糊精）：西安宏昌药业有限公司；CTMAB（溴化十六烷基三甲铵，分析纯）：北京化学试剂公司。所用试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。
三酸缓冲液的配制：用0.68 mL 81%的正磷酸、0.59 mL乙酸、0.62 g硼酸可配成250 mL三酸溶液，再用0.2 mol/L的NaOH溶液调制成所需pH缓冲溶液。
燕京啤酒、青岛啤酒、司陶特黑啤酒、哈尔滨啤酒、崂山啤酒、雪花啤酒：均购于当地超市。
本试验选用典型的5种表面活性剂：阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠［11］（SDS）；阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲铵（CTMAB）；非离子表面活性剂曲拉通-100（TritonX-100）、聚氧乙烯月桂醚（Brij-35）；超分子化合物β-环糊精（β-CD）。各表面活性剂的临界胶束浓度见表1。
表1 表面活性剂的临界胶束浓度（CMC）
Table 1 The critical micelle concentration of surfactants
表面活性剂 临界胶束浓度（CMC）十二烷基硫酸钠（SDS） 8.1×10-3Brij-35 9.5×10-6溴化十六烷基三甲铵（CTMAB） 9.2×10-4曲拉通（triton）X-100 3.0×10-4
从实际效果考虑，配制表面活性剂大于临界胶束浓度，所配制SDS液浓度为1.0×10-1mol/L，CTMAB液浓度为1.0×10-2mol/L，曲拉通X-100液浓度为3.0× 10-4mol/L，Brij-35的工作液浓度为1.0×10-3mol/L。准确称取β-环糊精标准品1.135 0 g，用二次蒸馏水溶解，定容到100 mL，浓度为1.0×10-2mol/L的工作液。iso-α-酸配制成100 μg/mL工作液。
1.3 方法
1.3.1 啤酒花浸膏中α-酸的提取与异构化［7］
称取5.095 1 g的酒花浸膏，用NaHCO3清洗，倾去废液，置于带搅拌及滴液漏斗的三颈烧瓶中，把1 mL 5%NaOH溶液稀释到20 mL，加入到三颈烧瓶中，在水浴中加热并搅拌，温度控制在50℃左右，继续滴加5%的NaOH溶液，使其pH达8.5～9。用盐酸将滤液酸化，再用甲苯将析出的α-酸萃取出来，用分液漏斗分开，在旋转蒸发仪上得到α-酸（60℃），称量得1.4698g，备用。
称取0.5 g α-酸于500mL的烧杯中，置50℃水浴，不断搅拌使α-酸全部溶解后（约5 min），加入MgCl2甲醇溶液，同时用1 mol/L的NaOH溶液调节pH，然后转入500 mL的圆底烧瓶，保持90℃完成异构化反应。冷却至室温，在用HCl酸化至pH＜2，用甲苯萃取析出的iso-α-酸，旋转蒸发器上蒸发溶剂得到iso-α-酸。
1.3.2 iso-α-酸紫外吸收测定
分别用移液管吸取1 mL100 μg/mL iso-α-酸工作液或样品，依次加入一定体积β-CD、缓冲溶液于10 mL比色管中，定容，在紫外分光光度计测量其吸收。
2.1 iso-α-酸的紫外光谱研究
按试验方法，在200 nm～400 nm范围内分别扫描α-酸及iso-α-酸的紫外吸收，扫描结果见图2。
图2 iso-α-酸在甲醇中的紫外吸收光谱
Fig.2 Ultraviolet spectrum of iso-α-acids in methnol
由图2可知，α-酸的最大吸收波长在231、328 nm处，iso-α-酸在258 nm处，两者紫外吸收有较大的变化。本文选择258 nm作为iso-α-酸测量波长。
2.2 不同表面活性剂对iso-α-酸紫外吸收的影响
表面活性剂，是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。双亲表面活性剂的独特结构决定了它有独特的性能，独特的性能使得它有特殊的应用。表面活性剂使iso-α-酸的水溶性增大，紫外吸收增强。
本文选用了十二烷基硫酸钠（SDS），溴化十六烷基三甲铵（CTMAB），曲拉通X-100（TritonX-100），聚氧乙烯月桂醚（Brij-35），β-环糊精（β-CD）作表面活性剂，考察了它们对iso-α-酸紫外吸收的影响，如表2。
表2 不同表面活性剂对iso-α-酸紫外吸收的影响
Table 2 Effect of different surfactants on Ultraviolet absorption of iso-α-acids
表面活性剂 吸收值ios-α-acids 0.279 Brij-35 0.292 SDS 0.293 CTMAB 0.272 β-CD 0.306 TritonX-100 0.203
试验表明，不同表面活性剂对iso-α-酸紫外吸收有较大的影响，吸收值大小顺序为：β-CD＞SDS＞Brij-35＞CTMAB＞TritonX-100，iso-α-酸溶于β-CD中吸收最大，本文选择β-CD作增敏剂。
2.3 酸度对iso-α-酸紫外吸收的影响
pH值对iso-α-酸的紫外吸收影响见图3。
图3 pH对iso-α-酸的紫外吸收影响
Fig.3 Effect of pH on ultraviolet absorption of iso-α-acids
由图3可知，iso-α-酸在酸性条件下的吸收随pH值的增大而减小，在pH值约为8.1时吸收值最小，之后随着pH值的增大又略有增大趋势。本文选择pH= 3.2三酸缓冲液控制测量体系酸。
2.4 工作曲线
准确量取一定浓度iso-α-酸溶液于10 mL比色管中，用二次水定容到刻度，在258 nm波长处测标准品溶液的吸光度值，在10 μg/mL～50 μg/mL范围内吸收值与iso-α-酸量呈良好的线性关系，如图4。
图4 iso-α-酸工作曲线
Fig.4 Work curve of iso-α-acids
回归方程为：A=0.2694C+0.0278（C的单位：μg/mL），线性相关系R=0.999 4，相对标准偏差RSD=1.40%（n=5）。
2.5 6种不同品牌啤酒中iso-α-酸含量测定及回收率
iso-α-酸作为啤酒风味原料之一的关键性成分，通过紫外吸收法测其含量、作为评价啤酒质量、苦味度简单、方便，可以满足不同风味喜好人群需求。试验分别取样品液1 mL，按试验方法测定种不同品牌啤酒中iso-α-酸含量，同时按标准加入法加入不同量标样iso-α-酸（20 μg），测定6种不同品牌啤酒中iso-α-酸的回收率，详细结果见表3。
6种不同品牌啤酒中iso-α-酸的含量顺序为：司陶特黑啤酒＞燕京啤酒＞哈尔滨啤酒＞崂山啤酒＞纯生啤酒＞雪花啤酒。回收率的范围在96.30%～104.70%之间，用紫外吸收法测定iso-α-酸含量，方法简便、可靠，结果准确。
表3 不同品牌啤酒中iso-α-酸的含量及回收率
Table 3 The contents and recoveries of iso-α-acid in beers
啤酒样品 样品中iso-α-酸含量/（μg/mL）RSD/（%，n=7）燕京纯生 38.76 20 58.17 97.05 0.16燕京 67.45 20 87.65 101.00 1.1司陶特黑 130.33 20 151.27 104.70 4.3哈尔滨 58.14 20 77.40 96.30 2.6雪花 35.53 20 55.87 101.70 1.49崂山 39.62 20 60.14 102.60 1.32加入量/μg测得量/μg回收率/%
参考文献：
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Determination of Iso-α-acids in Beer with β-CD Sensitized by Ultraviolet Spectrophotometry
Abstract：Hops is a kind of important flavour enhancer and raw material of brewing industry.In this article，iso-α-acid content in beer with 6 different brands were measure d through ultraviolet spectrophotometry.The effects of the different surfactants，medium acidity on absorption of α-acid were explored.The results showed that the α-acid had the strong absorption at 258 nm，the linear range of 10 μg/mL to 50 g/mL，correlation coefficent R=0.999 4，the RSD=1.40%（n=5），respectively.The sensitized action with different surfactants for α-acid absorption were as follows：β-CD，the SDS，Brij-35，TritonX-100 and CTMAB.The iso-α-acid contents（g/mL）in beer with 6 different brands were Si Tao Te Hei（130.33）＞Yanjing beer（67.45）＞Harbin beer（58.14）＞Laoshan beer（39.62）＞Yanjing pure draft beer（38.76）＞Snow Flower beer（35.53）.The average recoveries were in the range of 96.30%-104.70%with standard addition method，the results had been satisfied for sample determination.
Key words：beer；iso-α-acid；β-CD；ultraviolet spectrophotometry
DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.028
基金项目：忻州师范学院重点学科建设项目资助计划（xk201402）；山西省教育厅重点建设学科项目（20141010）；山西省高等学校教学改革项目（2015-100）
收稿日期：2015-06-20